活体生物发光和荧光成像技术应用讲座精选幻灯片

1、1 1 2 2仪器结构与组成仪器结构与组成3 3NightOWLLB983 4 4视野连续可调，自动聚焦 3.5 cm75 cm焦距焦距(cm)分辨率分辨率(m)3.5 50753205 53种荧光激发光源配件种荧光激发光源配件 环状环状照射装置照射装置 鱼尾型照射装置鱼尾型照射装置 鹅颈管照射装置鹅颈管照射装置 散射光滤光片散射光滤光片90 W 钨灯光源钨灯光源200 - 1100 nm可选滤光片可选滤光片6 6气体流量计气体流量计麻醉气体蒸发器麻醉气体蒸发器诱导麻醉箱诱导麻醉箱输送管道输送管道麻醉机组成麻醉机组成7 7祛除宇宙射线和祛除宇宙射线和背景背景视野校准视野校准定量分析功能定量分析

2、功能原始数据与处理原始数据与处理后数据分开存档后数据分开存档（根据（根据GLPGLP规则）规则）三种图像输出模三种图像输出模式式indiGoTM 功能强大的软件功能强大的软件8 8成像原理与特点成像原理与特点9 9目前的活体生物体内成像技术和方向目前的活体生物体内成像技术和方向可见光及荧光成像可见光及荧光成像 - -生物发光生物发光 （BioluminescenceBioluminescence） 与荧光（与荧光（FluorescenceFluorescence）正电子衍射成像（正电子衍射成像（Positron-Emission TomographyPositron-Emission Tomo

3、graphy，PETPET） -放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于检测肿瘤的放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于检测肿瘤的良恶性良恶性单光子衍射单光子衍射( (Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT)Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT)超声（超声（UltrasoundUltrasound） - - 物理学方法物理学方法 计算机断层摄影（计算机断层摄影（Computed Tomography Computed Tomography ，CTCT）

4、 -断层扫瞄技术，断层扫瞄技术，X-rayX-ray的衍生，物理学方法的衍生，物理学方法核磁共振（核磁共振（Magnetic Resonance Imaging Magnetic Resonance Imaging ，MRIMRI） -包括功能性核磁共振（包括功能性核磁共振（Functional MRIFunctional MRI，fMRIfMRI）, , 心血管核磁共振心血管核磁共振（Cardio-vascular MRI Cardio-vascular MRI ，cMRIcMRI），），等等等等1010几种常用活体体内成像技术的比较几种常用活体体内成像技术的比较结构成像结构成像功能成像功能

5、成像操作复杂操作复杂操作简单操作简单MRI核磁共振核磁共振Optical Imaging可见光成像可见光成像PET/SPET正电子衍射正电子衍射Ultrasound超声超声CT1111理想的光源：萤火虫荧光素酶（理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。记。遗传学标记遗传学标记实时、原位实时、原位多波长检测多波长检测标记癌细胞标记癌细胞标记细标记细菌菌标记转基因鼠标记转基因鼠1212荧光素酶的表达荧光素酶的表达 将将荧光素酶荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使合到

6、细胞染色体内，使荧光素荧光素酶得到持续表酶得到持续表达。达。启动子启动子染色体染色体体内表达体内表达外源注入外源注入底物底物活跃细胞活跃细胞体内发光体内发光1313标记细胞发光强度与定量分析标记细胞发光强度与定量分析1414小鼠皮下总计1000个 细胞或每mm 20个细胞可以很容易地被检测到，探测极限是一丛150 250个细胞.生物发光活体成像方面的灵敏度生物发光活体成像方面的灵敏度1515在微孔细胞板中少到在微孔细胞板中少到10 个细胞可以检测到个细胞可以检测到.生物发光微孔板检测的灵敏度生物发光微孔板检测的灵敏度1616如何提高灵敏度1717平均肿瘤体积平均肿瘤体积平平均均相相对对光光单单

7、位位对对数数值值生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞肿瘤细胞 ，皮下注射，皮下注射1818生物发光的应用生物发光的应用1919活体成像技术的主要应用活体成像技术的主要应用 标记细胞标记细胞 癌症及药物研究癌症及药物研究 标记病毒标记病毒, , DNA, RNADNA, RNA 病毒学及基因治疗病毒学及基因治疗 转基因动物模型转基因动物模型蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学，蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学， 等等等等 标记基因标记基因 siRNAsiRNA研究的应用研究的应用 干细胞干细胞, , 免疫免疫 其它其它 细胞

8、凋亡细胞凋亡 组织特异性基因表达组织特异性基因表达 标记细菌标记细菌2020体内药物分析的生物发光检测体内药物分析的生物发光检测1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射肿瘤细胞，皮下注射1414天天2121天天2828天天3535天天雄性雄性SCID小鼠小鼠处理方式处理方式 细胞数细胞数无治疗对照无治疗对照 2.2x1095- FU治疗治疗 2.8x108丝裂酶素丝裂酶素 3.6x106治疗治疗 小鼠小鼠 #6 n=7 小鼠小鼠 #40 n=8(从第从第11天开始给天开始给药药) 小鼠小鼠 #31 n=8 (从第从第11天开始给天开始给药药)2121对照组于第对照组于第五周结束观五周

9、结束观察察生物发光强生物发光强度度 Exp #081雄性雄性nu/nu CRn=13,5,7n=13n=6/7n=3/5生物发光检测体内药物治疗的复发作用生物发光检测体内药物治疗的复发作用5x105 ，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌肿瘤细胞，原位前列腺癌1周周3周周5周周7周周8周周生理盐水对照组生理盐水对照组（小鼠（小鼠#40#40）静注，静注，3 3次次/ /周，周， 第二、三周第二、三周 5- 5-FuFu治疗组治疗组（小鼠（小鼠#38#38）100 100 mg/kgmg/kg 静注，静注，1 1次次/ /周，周， 第二、三、四周第二、三、四周 丝裂酶素治疗组丝裂酶素治疗

10、组（小鼠（小鼠#4#4）2 2mg/kgmg/kg 静注，静注，3 3次次/ /周，周， 第二、三周第二、三周2222肺癌模型2323乳腺癌原位接种2424原位胰腺癌模型2525白血病模型2105 Arf-/-p185+luc+LICs.2011年年9月月 BLOOD2626BCL6 enables Ph1 acute lymphoblastic leukaemia cells to survive BCRABL1 kinase inhibition 2011年5月 NATURE2727U87 U87 脑胶质瘤成像脑胶质瘤成像 cancer research 2011,8cancer rese

11、arch 2011,8PTA of U87 humangliomas in mouse brains. A,representative bioluminescenceimages of nude mice bearingU87-TGL tumors with differenttreatments (see Materials andMethods).2828骨肉瘤转移机理研究2929肿瘤转移肿瘤转移3030乳腺癌转移实验乳腺癌转移实验3131利用转利用转基因技术自发肿瘤基因技术自发肿瘤的研的研究究MYC inactivation uncovers pluripotent different

12、iation and tumour dormancy in hepatocellular cancer NATURE 20043232cancer cell 2004 , 103333抗体药物研究CD137 stimulation enhances the antilymphoma activity of anti-CD20 antibodies3434研究干细胞造血作用研究干细胞造血作用Cao et al, PNAS 2004Percent GFP+ Cells (corrected)80706050403020100FVB N1 N2 N3 N4 N5 P1 P2 P3 P4 P5 P6T

13、otal leukocytesGranulocytesB cellsT cellsDonor line crossed to FVB Cg-Tg a GFP Tg line3535心脏内成像心脏内成像BMCs withgreen fluorescent protein-FLuc were administered through thetail vein 24 hours after myocardial infarction. BLI demonstrateda greater number of BMCs homed to the periinfarct region inthe doub

14、le-knockdown group, with peak homing at day 7.3636免疫治疗研究免疫治疗研究EDINGER et al，2003，bloodTrafficking of CIK cells3737当共转染当共转染 pGL3-luc 或或HCV-luc 表达载体特异的表达载体特异的 siRNA时，时，可抑制报告基因可抑制报告基因Luciferase的表达的表达(McCaffrey et al. Nature, 408, 38-39, 2002. Copyright permission from Nature publishing group)抑制荧光素酶抑制荧光

15、素酶(pGL3-control)抑制丙型肝炎病毒抑制丙型肝炎病毒 (pShh1-Ff1)3838外源质粒在体内表达 质粒p GL3-LUC质粒，通过水动力方法注入小鼠体内后，在肝脏中与luciferase反应后大量表达3939实验性心内膜炎症的抗生素筛选实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠模型大鼠模型对对照照组组vancomycinvancomycincefazolin gentamicin4040 细菌的感染模式研究细菌的感染模式研究Membranous Cells in Nasal-Associated Lymphoid Tissuethe Respiratory Mucosal Pathog

16、en Group A Streptococcus14141基因治疗载体的构建基因治疗载体的构建AdTSTA-FL的表达活性比的表达活性比AdCMV-FL高高100倍以上倍以上AdTSTA-FL（107）AdCMV-FL（107）Days 5 7 10 Days 5 7 10 13138006004002005004003002001001031054242A genetically humanized mousemodel for hepatitis C virus infection4343体内蛋白质体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用 LUC N端 与 C端 分开时并不发光

17、 蛋白质A 与蛋白质B 分别与LUC N端 和 C端 连接 两组蛋白由不同的质粒诱导表达蛋白蛋白A蛋白蛋白BLuc N端端Luc C端端蛋白蛋白A 蛋白蛋白BLuciferase发光发光相互作用相互作用+4444活体动物体内观察细胞凋亡活体动物体内观察细胞凋亡LUCIILUCIILaxman, et al PNAS V.99Caspase siteCaspase site发光发光ApoptosisCaspase 表达表达4545活体动物细胞及组织特异性基因表达活体动物细胞及组织特异性基因表达 构建双重标记的细胞株(RENILLA & FIREFLY LUCIFERASE), 识别不同底

18、物的发光酶 研究基因的启动子控制 FIREFLY LUCIFERASE 表达, 与兴趣基因平行表达. RENILLA LUCIFERASE 作为内参, 标记细胞数量 RENILLA LucFIREFLY LucPcRen LucFir LucP53发光发光发光发光4646荧光和量子点标记的荧光和量子点标记的应用应用47474H9在荷瘤小鼠中的分布 (U87V3) 50g cy5.5 labeled 4H9, i.v.2hr6hr24hr仰卧仰卧右侧卧右侧卧4848GFP标记的肺癌皮下模型标记的肺癌皮下模型4949药物的肿瘤靶向性研究5050荧光染料（荧光染料（Cy5.5)Cy5.5)标记的探针

19、对肿瘤细胞的识别标记的探针对肿瘤细胞的识别5151量子点标记成像5252转基因动物的应用转基因动物的应用5353基因激活基因激活 表达表达 生物发光生物发光 研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，既基因的靶基因是否表达，既基因的“开开”“”“关关”现象。现象。转基因动物模型原理转基因动物模型原理生物大分子合生物大分子合成成5454 血管内皮细胞生长因子受体血管内皮细胞生长因子受体2 2（Vascular endothelial cell growth factor Vascular endothelial cell growth factor receptor 2, VEGFR2receptor 2, VEGFR2）是是 VEGFVEGF的