生物化学实验

1、生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部实验一 酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。二、原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪 蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时, 酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质 后便可得到纯的酪蛋白。三、器材1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计四、试剂与材料1、牛奶2500mL2、95乙醇3、无水乙醚1200mL4、0.2molL pH 4.7醋 酸 醋 酸 钠 缓 冲 液3000mL5、 乙 醇 乙 醚 混 合 液2

2、000mL五、操作1、将100mL牛奶加热至40C。在搅拌下慢慢加入 预热至40C、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至 室温。离心15分钟(3 000r/min)。弃去清液，得酪 蛋白粗制品。2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r/min)，弃 去上清液。3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。 用乙醇乙醚混合液洗 沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。1200mL5、准确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白g/100mL牛乳(g%)得率：测得含量理论

3、含量100%思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1.学习分光光度计的原理和使用方法。2.学习测定淀粉酶活力的方法。3了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。2（CH0O5）n+n H2On C12H22O11麦芽糖有还原性，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定o休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。三、器材7.离心机 四、试剂和材料1、小麦种子

4、2、o.1标准麦芽糖溶液 精确称量100 mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。3. pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。4、1淀粉溶液1.25mL刻度试管2.吸管3.离心管4.乳钵5.分光光度计6.恒温水浴1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲 液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。5、13，5二硝基水杨酸试剂1将1.00g3，5二硝基水扬酸溶于20ml 2ML1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。6、1氯化钠溶液五

5、、实验操作1、 种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25C恒 温箱内或在、室温下发芽。2、酶液提取 取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入 乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温 下放置20分钟，搅拌几 次。然 后 将提取 液离心 （1500r/min）67分钟。将上清液倒人量筒， 测定酶提 取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上） 。3、酶活力测定（1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂(各试剂须在25C预热10分钟)试管标号、试剂1234干燥种子 的酶提取 液发芽第3或第4天的幼苗的酶

6、提取液标准管空白管酶液(mL)0.50.5标准麦芽糖溶液(mL)0.51%淀粉溶液(mL)1111水(mL)0.5将各管混匀，放在25C水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1%3,5二硝基水杨酸溶液2mL(2)取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温，加水稀释至25mL并混匀。在A500nm处测定各管的吸光度。填入表中试管号干燥种子发芽第3或标准管空白管2、实验结果说明什么?的酶提取液第4天的幼苗的酶提取液A500nm吸光度4、计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系,A酶C标准C酶A标准本实验规定：25C时3min内水解淀粉释放1mg麦芽 糖所需的酶量为1个酶活力单位（u）。酶活力计算公

7、式 为：酶活力-V酶n酶式中：C酶酶液麦芽糖的浓度，V酶提取酶液的总体积，n酶酶液稀释倍数。思考题1、为什么此酶提纯整个过程在05条件下进行？而测酶的活力时要在25预保温？反应后又放入沸水 浴中？、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：.二原点到层析点中心的距离二bf原点到溶剂前沿的距离a在一定的条件下某种物质的只Rfa值是常数。Rf值的大小与物质的结构、质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析 温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

8、三、器材1层析缸2毛细管3喷雾器4培养皿5.层析滤纸（新华一号）实验三纸层析法分离鉴定氨基酸溶剂前沿“币层析点b性-兴-原点四、试剂4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合， 充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩 展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养 皿中备用。2、 氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、 苯丙氨酸、 亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。 各5mL3、显色剂50100mL0. 1%水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2.取层析滤纸（

9、长22cm、宽14 cm）一张。在纸 的一端距边缘23cm处用用铅笔划一条直 线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。1 2 3 4 5 63.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最 大不超过3mm。1、扩展剂650mL4.扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将 盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸 中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下， 扩展剂 的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升1520 cm时 即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用 吹风机热风吹干。5.显色 用喷雾器均匀喷上O.1 茚三酮 正丁醇溶液，然

10、后置烘箱中烘烤5分钟(100C)或用热风吹干即可显出 各层析斑点。6.计算各种氨基酸的只Rf值。思考题1、何谓纸层析法2、何谓片Rf值影响Rf值的主要因素是什么3、怎样制备扩展剂3、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四 酶的特性、目的 加深对酶的性质的认识。二、内容本实验由温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影 响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专性4组实验组成。(一)温度对酶活力的影响1、原理酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40C,植物酶的最适温度为5060C。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100C，其活性井无明显

11、改变，但在100C的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2、器材(1)试管及试管架(2)恒温水浴(3)冰浴(4)沸水浴3、试剂和材料(1)0.2淀粉的0.3氯化钠溶液150mL需新鲜配制用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水, 半分钟后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可根据 各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用。(3)碘化钾一碘溶液50mL将碘化钾20g及碘IOg溶于100mL水中。使用前稀 释10倍。4、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大 小， 遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的 糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度

12、 下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘 呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按下表加入试剂:管号123淀粉溶液(mL)1.51.51.5稀释唾液(mL)11稀释200倍的唾液50mL煮拂过的稀释唾1液(mL)摇匀后，将1、3号两试管放入37C恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出（将2号管内液体分 为两半），用碘化钾一碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉 被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放人37C水浴中继续保温10分钟后， 再用碘液实验，结果如何（二）pH对酶活性的影响1、 原理酶的恬力受环境pH的影响极为显着。 不同酶的最适pH值不同。本实验观察

13、pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾 液淀粉酶的最适pH约为6.8。2.器材（1）试管及试管架（2）吸管（3）滴管（4）50mL锥形瓶5）恒温水浴3、试剂和材料（1）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液250(3) 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液600mLmL（2）稀释200倍的新鲜唾100mL(4) 0.1 mol/L柠檬酸溶液400MI(5)碘化钾一碘溶液50mL(6) pH试纸pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种4、操作取4个标有号码的50mL锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.08.0的4种缓冲液。锥形瓶号码

14、0.2mol/L磷酸氢二钠0.1 mol/L柠檬酸pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL,分别注入4支带 有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶 液2 mL和稀释200倍的唾液2mL。向各试管中加入稀 释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37C恒温水浴中保温待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管 取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾碘 溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时， 向所有试管依次添加12滴碘化钾碘溶液。添加碘 化钾碘溶液的时间间隔，从

15、第1管起，亦均为1分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉 酶活性的影响。三)唾液淀粒酶的活化和抑制1、原理 酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。2、器材(1)恒温水浴(2)试管及试管架3、试剂和材料(1)0.1淀粉溶液150mL (2)稀释200倍的新鲜唾液150mL(3)1氯化钠溶液50mL(4)1硫酸铜溶液50mL(5)1%硫酸钠溶液50mL(6)碘化钾一碘溶液100mL4、操作管号12340.1%淀粉溶液(mL)1.51.51.51.5稀释唾液(mL)0.50.50.50.51%硫酸铜溶液(mL)0.51%氯化钠溶掖(mL)0.51

16、%硫酸钠溶液(mL)0.5蒸馏水(mL)0.537C恒温水浴、 保温10分钟碘化钾一碘溶液(滴)23232323现象解释结果；说明本实验第3管的意义。(四)酶的专一姓1原理酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和 蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有还 原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化 蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的 水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。2、器材(1)恒温水浴沸水浴试管及试管架3、试剂和材料(1) 2%蔗糖溶液150mL(2)溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液150mL需新鲜配制间隔

17、各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37C恒温水浴中保温。(3)稀释200倍的新鲜唾液100mL(4)蔗糖酶溶液100mL将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤23次(离心法), 然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100 g,置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。(5) Benedict氏试剂200 mL无水硫酸铜17.4 g溶于100 mL热水中，冷却后稀释 至150mL。取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g和600 mL水共热，溶解后冷却并加水至850 mL。再将冷却的150 mL硫酸铜溶液倾入。本试剂可长

18、久保存。4、操作(1)淀粉酶的专一性管号1234561%淀粉溶液(滴)4442%蔗糖溶液（滴）444稀释唾液（mL）11煮沸过的稀释唾液（mL）11蒸馏水（mL）1137C恒温水浴15分钟Ben edict试剂(mL)111111沸水浴23分钟现象解释实验结果（提示： 唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽 糖酶）。（2）蔗糖酶的专一性管号1234561%淀粉溶液（滴）4442%蔗糖溶液（滴）444蔗糖酶溶液（mL）11煮沸过的蔗糖酶溶11液(mL)蒸馏水(mL)1137C恒温水浴15分钟Be nedict试剂(mL)111111沸水浴23分钟现象解释实验结果思考题1、 什么是酶的最适温度及其应用意义

19、2、 什么是酶反应的最适pH对酶活性有什么影响3、 什么是酶的活化剂4、 什么是酶的抑制剂与变性剂有何区别5、 本实验结果如何证明酶的专一性实验五 菜花中核酸的分离和鉴定一、目的初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和RNA、DNA的定性检定。、原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽 提菜花匀浆， 以除去酸溶性小分子物质， 再用有机溶剂， 如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后 用浓盐溶液（10%氯化钠溶液）和0.5 mol/L高氯酸（70C）分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后 所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖 和脱氧

20、核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测 定核酸。1、核糖的测定 测定核糖的常用方法是苔黑酚（即3，5二羟甲苯法）。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5二羟甲苯在沸水浴中加热1020分钟后，有绿色物 产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠 醛，后者再与3，5二羟甲苯作用产生绿色物质。DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。2脱氧核糖的测定 测定脱氧核糖的常用方法是二 苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺 在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成3羟基一6酮基 戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。100CDNA+二苯胺试剂蓝色物

21、此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。三、器材1.恒温水浴2.电炉3,离心机4.布氏漏斗装置5.吸管6.烧杯7.量筒8.剪刀四、试剂和材料1、新鲜菜花2、95%已醇600 mL 3、丙酮400 mL4、5%高氯酸溶液200 mL 5、0.5mo1/L高氯酸溶液200 mL6、10%氯化钠溶液400 mL7、标准RNA溶液(5 mg/l00mL)50mL8、标准DNA溶液(15 mg100mL)50mL 9粗氯化钠250g10海砂5 g 11二苯胺试剂60 mL将1 g二苯胺溶于100mL冰醋酸中

22、，再加入2.75mL浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀)。12三氯化铁浓盐酸溶液25 mL13苔黑酚乙醇溶液200 mL1、核酸的分离(1)取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95%乙醇和400 mg海砂，研磨成匀浆。然后用布 氏漏斗抽滤，弃去滤液。(2)滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤 液。再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5分钟后抽干(用 力压滤渣，尽量除去丙酮)。(4)在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5高氯 酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。(5)将滤渣悬浮于20 mL 95乙醇中，抽滤， 弃去滤滤渣中加人20 mL丙酮，搅拌5分钟，抽滤至

23、于， 用力压滤渣尽量除去丙酮。(7)将干燥的滤渣重新悬浮在40 mL 10%氯化钠溶液 中。在沸水浴中加热15分钟。放置，冷却，抽滤，留 滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为 提取物一。(8)将滤渣重新悬浮在20mL 0.5 mol/L高氯酸溶液 中。加热到70C、保温20分钟(恒温水浴)后抽滤，留滤 液(提取物二)。2.RNA,DNA的定性检定(1)二苯胺反应管号12345蒸馏水(mL)1-DNA溶液(mL)-1-RNA溶液(mL)-1-提取物一(mL)-1-摄取物二(mL)-1二苯胺试剂(mL)22222放沸水浴中10分钟后的现象(2)苔黑酚反应管号12345蒸馏水(mL)1-

24、DNA溶液(mL)-1-RNA溶液(mL)-1-提取物一(mL)-1-摄取物二(mL)-1三氯化铁浓盐酸溶液(mL)22222苔黑酚乙醇溶液(mL)0.20.20.20.20.2放沸水浴中10分钟后的现象思考题1.核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物 质本实验是怎样除掉的2 实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合 物DNA产生 蓝色物质实验六 紫外分光光度法测定核酸的含量一、目的1.了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波

25、长处。一般在A260nm波长下，每mL含1,gDNA溶液的 光吸收值约为0.020,每mL含1,gRNA溶液的光吸收 值约为0.022。故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作 简便,迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等 能吸收紫外光的物质,则测定误差较大,故应设法预先除去 三、器材1.分析天平2.离心机3.容量瓶4.紫外分光光度计5.吸管6.冰浴或冰箱四、试剂1、5%6%氨水2、钼酸铵高氯酸试剂（沉淀剂）如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL 70%高氯酸和0.5g钼酸 铵。五、操作1用分析天平准确称取待测的核酸样品500

26、mg,加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%6%氨水调至pH7,定容到50mL。2.取2支离心管， 向第一支管内加人2mL样品溶液 和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或 冰箱中放置30分钟后离心（3000 rmin，10分钟）。从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液， 用蒸馏水定 容到50mL。用光程为1cm的石英比色杯，于260mn波长处测其光吸收值（Ai和A?）。六、计算如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透 析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（2050卩g/mL ）在紫外分光光度计上直

27、接测定。实验七 总氮量的测定凯氏定氮法一、目的 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、原理常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸 及氨基酸）的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时， 其中的碳氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成 氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为 “消化”。但是，此反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催 化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程表示如下：CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+NH32NH3+H2SO4（NH4）2SO4弄浓浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借 水蒸气将产生的氨

28、蒸留到一定量、一定浓度的硼酸溶液 中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用 标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为 止，最后根据使用的标准酸的摩尔数计算出待测物中的 总氮量。三、仪器1.50 mL消化管或100 mL凯氏烧瓶2改进型凯氏定氮仪3. 50 mL容量瓶4.3 mL微量滴定管5.分析天平6.烘箱7.电炉8.1000mL蒸馏烧瓶1.消化液（过氧化氢：浓硫酸：水二3：2：1）200mL2粉末硫酸钾硫酸铜混合物16gK2S04与CuS04 5H20以3:1配比研磨混合。330氢氧化钠溶液1 000mL42硼酸溶液500mL5标准盐酸溶液（约001 molL） 600mL6

29、混合指示剂（田氏指示剂）50mL由50mL 01甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1 甲基红 乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示 剂酸性时 为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7市售标准面粉和富强粉.各2g五、操作方法改进型凯氏定氮仪 改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构 基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷9小玻璃珠四、试剂10.远红外消煮炉凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。改进型凯氏蒸馏装置的结构如图所示进型凯氏蒸馏装置1水蒸汽发生器2反应室3.水蒸汽排气孔4.排水排气孔5外源水入口6.进样口7.加样漏斗8.冷凝器9.冷凝器出口10.自来水入

30、口14.排水柱15.排水柱入口16.排水柱入口17.冷11.通气室出口13.通气室出口凝水和废水出口自由夹可分成3部分来叙述：(1)水蒸汽发生器和反应室 水蒸汽发生器有3个开 口，3、4、5，反应室有1个开口，6。2)冷凝器和通气室 冷凝器有2个开口，9、10，通气室 有有2个开口，12、13(3)排水柱 排水柱有3个开口，15、16、17。 安装时，先将主体部分固定在支架上， 其底部放上电炉。 然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连 接，并放上自由夹。最后长橡胶管连接进水口10和出 水口172样品处理某一固体样品中的含氮量是用l00g该物质(干重)中所 含氮的g数来表示(%)

31、。因此在定氮前，应先将固体样 品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105C,因为非游离的水都不能在100C以下烘干。在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105C的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内， 待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重次，直到两次称量数值不变，即达恒 重。精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样 品。3消化取4个100 mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各 加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g,催化剂(K2SO4CuSQ5H20)200 mg，消化液5 mL。注意加样 品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3

32、及4号瓶中各加0.1mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的 催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有 的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电 炉上消化。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈 待瓶 内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出S02白烟后，适当加 强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消 化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL(注意慢 加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾入50 mL的容量瓶 中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀 释到刻度，混匀备用。4，蒸馏(1)蒸馏器的洗涤 接通冷凝水， 先向蒸汽发生器中加入 一定量的水(以排水口高度为宜)用电炉将其

33、加热烧开。 然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或 者将电炉移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽 发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗35次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，12%硼酸溶液和12滴指示剂的混合液。蒸馏数分钟 后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏 装置内部已洗涤干净。(2)蒸馏 取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 12%硼酸 溶液和12滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖 备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。 将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下， 并使冷凝器下端浸没在液体内。用移液管取5 mL消化液

34、，细心地由加样室下端加入 反应室，随后将已准备好的30%NaOH溶液5mL加入, 关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。关闭自由夹打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢 出）。当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约23分钟）， 开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离 开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。打 开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此35次。 最后将自由夹、同时打开，将蒸汽发生器内的全部 废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后， 继续下一次蒸馏。待样品和空白消

35、化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。（3）滴定 全部蒸馏完毕后， 用标准盐酸溶液滴定各锥形 瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定 终点。(4)计算c为标准盐酸溶液摩尔浓度；v1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；v2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均 数；w为样品重量(g)。14为氮的相对量子质量。 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则， 样品中蛋白质含量()=总氮量x625若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质， 则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙 酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮 量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮， 再进一步算出蛋白质含量。蛋白氟=总氮非蛋白氮蛋白质含量(g%)二蛋白氮x6.25思考题1、何谓消化如何判断消化终点2、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么3固体样品为什么要烘干mL4蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中5如何证明蒸馏器洗涤干净6本实验应如何避免误差实验八 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一 般原理二、原理醋酸纤维薄膜