荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育

1、荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育王晓楠袁齐宏袁张金凤袁光杨其袁唐灿明*渊南京农业大学农学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室袁江苏南京210095冤摘要院为了研究黄萎病菌的侵染机制袁通过农杆菌介导的转化方法袁将绿色荧光蛋白基因导入落叶型黄萎病菌VD07038袁将红色荧光蛋白基因导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色尧红色荧光信号的阳性转化子遥经过分子验证和连续继代培养袁证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性遥通过对转化子的菌落形态尧生长速度和致病力进行检测袁发现大部分转化子与野生型基本一致袁少量转化子发生变异袁其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核袁致病力显著下降遥利

2、用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况遥结果表明袁在接菌12h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面曰接种79d后袁菌丝入侵到棉花根部的维管组织遥本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程袁并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性袁为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法遥关键词院棉花曰大丽轮枝菌曰绿色荧光蛋白曰红色荧光蛋白曰转化中图分类号院S435.621文献标志码院A文章编号院1002-7807渊2014冤03-0221-07WangXiaonan,QiHong,ZhangJinf

3、eng,GuangYangqi,TangCanming*(,210095,)Inordertoanalysetheinfectionmechanismof,encodinggreenfluorescentproteinwastransferredin-todefoliatingisolateVD07038andencodingredfluorescentproteinwastransferredintonon-defoliatingBp2via-mediatedtransformation.Finally,positivetransformantstaggedbygreenfluores-ce

4、ntproteinorredfluorescentproteinwereobtained.ThehygromycinBgeneticstabilityoftransgenicprogenieswastestedbyseriescultureandmolecularverification.Accordingtocolonymorphology,growthrateandpathogenicity,wefoundthattraitsofmostoftransformantsweresimilartothoseofwild-type,fewtransformantstendedtoformmuta

5、nts.TansformantsBp2R-30didnotproducemicrosclerotiaanditspathogenicitydecreasedsignificantly.UsingtheGFP-taggedVD07038G-10iso-late,colonizationofthefungusinrootsofthesusceptiblecottonSumian22wasinvestigated.Astheresultsshowedthat,12hoursafterinoculationviatherootdippingmethods,rootssurfaceofSumian22w

6、erecoveredwithconidia,7-9daysafterinocu-lation,hyphaefromtheleadingedgeofthecolonyprogressedacropetallyupthexylemvesselsofinfectedroots.VD07038G-10taggedbyfluorescentproteincanbeusedforobservationitsinfectionprocessinrealtimeoncottonrootsandi-dentificationofresistanceofdifferentcottonvarietiestothis

7、strain.Thisstudyprovideanewmethodforresistanceevaluationof.cotton;Kleb.;greenfluorescentprotein;redfluorescentprotein;transformation收稿日期院2013-11-22作者简介院王晓楠渊1988-冤袁女袁硕士袁2011101118曰*通讯作者袁tangcm基金项目院高等学校博士学科点专项科研基金渊20120097110024冤曰国家自然科学基金(31071459)黄萎病对棉花的危害十分严重袁是影响棉花高产稳产的首要障碍遥我国棉花黄萎病是由土壤传播的病原真菌大丽轮枝菌(K

8、leb.)引起的1遥大丽轮枝菌的寄主范围非常广泛袁可侵染600多种植物袁这些植物大部分属于经济作物2-5遥番茄尧马铃薯尧黄瓜尧棉花尧烟草尧辣椒和茄子等都对其敏感袁而一般禾本科作物如水稻尧玉米和高粱等不受侵染袁且大丽轮枝菌的寄棉花学报CottonScience2014袁26渊3冤院221227棉花学报26卷主范围还在逐渐扩大6遥在没有合适寄主的情况下袁黄萎病菌可以形成黑化的休眠结构微菌核在土壤中长期存在袁防治难度很大7遥荧光蛋白具有稳定尧直观尧操作方便的荧光性质和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等优点袁作为报告基因已经广泛地应用于丝状真菌的研究中遥绿色荧光蛋白(Greenfluo-res

9、centprotein,GFP)于1962年由Shimomura等8首先从发光水母()中纯化得到袁在真菌蛋白的亚细胞定位尧转化子致病力检测和与寄主植物互作方面表现出了较大的优势遥在真菌研究中常用的绿色荧光蛋白大多都经过了修饰袁如sGFP和EGFP袁修饰后的蛋白赋予真菌菌丝更强的荧光水平袁并且对真菌的生长和致病力影响较小9-10遥Pliego等将转入白纹羽菌获得稳定遗传表达绿色荧光的转化子袁Andrie等利用基因在从马铃薯中分离的大丽轮枝菌菌株中成功标记了绿色荧光11-12遥1999年袁第一个红色荧光蛋白drFP583渊DsRed冤被报道袁而后被应用于植物和病原菌互作的研究13-14遥mCher

10、-ryRFP是由Shaner在红色荧光蛋白DsRed的单体mRFP1的基础上袁通过多轮随机和定点突变得到15遥优化后的mCherry比mRFP1荧光更亮袁成熟时间更短袁激发和发射波长更长袁分别为587nm和610nm遥因其诸多优良性能袁mCherry备受研究人员的青睐遥本研究通过农杆菌介导的转化方法将绿色荧光蛋白基因导入落叶型黄萎病菌VD07038袁将红色荧光蛋白基因导入非落叶型黄萎病菌Bp2袁分别获得了能够表达绿色荧光信号尧红色荧光信号的阳性转化子袁筛选到遗传稳定尧致病力与野生型一致的转化子袁可用于研究黄萎病菌以及黄萎病菌和棉花之间的互作关系遥材料和方法本实验于20112012年在南京农业大

11、学农学院作物遗传与种质创新国家重点实验室完成遥试验材料遥本试验所用棉花品种为感黄萎病的陆地棉品种苏棉22袁用于转化子致病力检测遥遥落叶型黄萎病菌菌系VD07038由中国农业科学院棉花研究所朱荷琴提供袁非落叶型菌系Bp2由江苏省农业科学院植物保护研究所林玲提供遥遗传转化所用农杆菌渊冤菌株为EHA105遥携带有和基因的质粒PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP由本实验室构建遥和基因以及抗性选择标记基因潮霉素B基因都受构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子gpd调控遥试验方法遥分别将2种黄萎病菌接种在含0尧25尧50尧75和100滋g窑mL-1潮霉素B的PDA平板上检测其生长情况袁确定了野

12、生型黄萎病菌VD07038和Bp2对潮霉素B的耐受浓度都为50滋g窑mL-1遥参照Maruthachalam等16提出的方案进行农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化袁所得到的阳性转化子按照梯度稀释的方法袁进行连续2次的单孢分离袁获得单孢纯化菌株遥遥采用CTAB法提取菌株DNA袁对潮霉素B抗性基因(Hyg-4F:TCGTTATGTTTATCGGCACTTT;Hyg-5R:GATGTTGGCGACCTCGTATT)进行PCR扩增袁产物用1%的凝胶电泳进行鉴定遥将转化子接种到不加抗生素的PDA培养基上传代5次袁再转接到含50滋g窑mL-1潮霉素B的PDA培养基上生长袁用荧光显微镜渊Nikon袁日本冤观察其荧

13、光表达情况遥遥用直径0.7cm的打孔器在平板上黄萎病菌的菌丝生长最边缘的地方取大小相同的菌饼袁接种到PDA平板中央袁置于25恒温培养箱培养袁每隔1d用直尺测量菌落的直径袁观察菌落生长速度及菌落形态袁连续观察18d遥将0.7cm的菌饼一块接种于100mL液体培养基中袁25尧150r窑min-1震荡培养袁每天测定其产孢量袁连续测定7d遥以野生型菌株VD07038和Bp2为对照袁实验重复3次遥遥将直径0.7cm菌饼接种于含0.5%渊质量浓度冤羧甲基纤维素和果胶的Czapek培养基平板上袁25恒温培养箱培养572223期d遥在平板上加入约20mL0.1%的刚果红染色30min袁水洗2次袁再用20mL浓

14、度为1mol窑L-1的NaCl脱色2次袁每次约20min遥以野生型菌株为对照袁通过比较菌落周围透明圈的有无或大小判断突变体菌株间胞外酶产生的差异遥遥在苏棉22植株的12片真叶期袁将各转化子的孢子浓度调整到1.0伊106mL-1袁取10mL孢子悬浮液接种于棉花根部遥分别以野生型菌株VD07038尧Bp2和无菌水作为阳性对照和阴性对照袁在接菌后的第2尧3尧4和5周袁调查病情并计算病情指数袁参照Huang等的方法17进行遥实验重复5次遥遥将VD07038G-10转化子接种于PDA液体中袁25尧150r窑min-1震荡培养45d袁双层灭菌纱布过滤菌液袁用无菌水稀释到4伊106mL-1遥待棉花子叶展平时

15、袁在无菌的条件下将棉株连根拔起遥将根在无菌水中冲洗干净袁然后置于VD07038G-10的孢子悬浮液中浸泡5min遥将接菌后的幼苗转移到新灭菌的蛭石中袁置于25光照培养箱中袁并与接种后12h尧3d尧5d尧7d尧9d和14d取样袁观察VD07038G-10在苏棉22根部的侵染情况遥结果与分析黄萎病菌的遗传转化及转化子遗传稳定性分析通过农杆菌介导的转化方法袁分别将PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP这两个载体的T-DNA区导入野生型黄萎病菌菌株VD07038和Bp2袁获得带绿色荧光蛋白渊sGFP冤标记的VD07038转化子及红色荧光蛋白渊mCherryRFP冤标记的Bp2转化子遥挑取少量菌

16、丝制片袁利用荧光显微镜分别在蓝光尧绿光和可见光模式下对所有阳性转化子的荧光表达情况进行观察袁发现所有阳性转化子袁无论其处于孢子阶段还是菌丝阶段袁均能产生绿色荧光或红色荧光渊图1c袁d冤袁但不同转化子间荧光信号强弱不一袁而野生型菌株不能产生荧光遥这表明2种荧光蛋白被成功导入野生型黄萎病菌袁并且在黄萎病菌的各个细胞结构中均能表达遥其中VD07038G-10尧VD07038G-9尧Bp2R-17和Bp2R-30等转化子能够呈现较强的荧光信号遥将4个转化子接种到不加抗生素的PDA培养基上分别传代5次袁再转接到含50滋g窑mL-1潮霉素B的PDA培养基上袁发现4个转化子都能生长并且均能产生荧光袁表明和基

17、因分别稳定地插入了野生型VD07038和Bp2菌株的基因组中遥转化子的分子检测以野生型黄萎病菌VD07038和Bp2及4个转化子的基因组DNA为模板袁利用基因的特异性引物进行PCR扩增袁携带有和基因的质粒PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP作为阳性对照袁无菌水作为阴性对照遥电泳检测结果显示所有的转化子中均可以扩增出约500bp的目的片段袁而野生型菌株未能扩出渊图2冤袁从而进一步证明PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP这两个载体的T-DNA区已被成功导入野生型黄萎病菌遥转化子致病力相关性状分析遥野生型菌株VD07038和Bp2在PDA培养基上袁25恒温培养时表现菌落中部菌丝质

18、地致密袁菌丝白色袁生长旺盛袁正面和背面都有黑色素和微菌核遥对得到的转化子的菌落形态进行观察袁发现大部分转化子的菌落形态与野生型菌株基本一致袁而有些转化子的形态发生了较大变化袁表现为微菌核产生量下降袁只在菌落中间极小的部位产生黑色素或者不产生微菌核袁如院Bp2R-30遥遥以野生型菌株为对照袁对转化子的生长速度尧产孢量进行考察遥发现在PDA培养基上袁所有转化子的生长速度都略低于野生型菌株袁其中Bp2R-30的生长速度显著低于野生型菌株Bp2渊图3冤遥产孢量测定结果表明袁大部分转化子与野生型相差不大袁含基因的转化子VD07038G-10尧VD07038G-9与野生型一致袁都是在接种后4d出现产孢高峰

19、期遥含基因的转化子Bp2R-17与野生型Bp2一致袁在接种后6d出现产孢高峰期曰而转化子Bp2R-30产孢量显著低于野生型Bp2袁且产孢高峰出现在接种后4d袁比野生型提前2d渊表1冤遥王晓楠等院荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育223棉花学报26卷a院白光下转化子VD07038G-10的菌丝和孢子囊曰b院蓝光下转化子VD07038G-10菌丝和孢子囊绿色荧光的表达曰c院白光下转化子Bp2R-17的菌丝和孢子囊曰d院绿光下转化子Bp2R-17菌丝和孢子囊红色荧光表达曰e院接种12h后袁转化子VD07038G-10孢子在苏棉22根部的吸附情况曰f院接种5d后袁转化子VD07038G-10的

20、孢子在皮层中的扩展情况遥a院HyphaandsporangiumofVD07038G-10underbrightfield曰b院ExpressionofinhyphaandsporangiumofVD07038G-10underbluelight曰c院HyphaandsporangiumofBp2R-17underbrightfield曰d院Expressionofinhy-phaandsporangiumofBp2R-17undergreenlight曰e院12hoursafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10lyingontherootsur-faceof

21、Sumian22曰f院5daysafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10extendedinthecortex.图1转化子VD07038G-10和Bp2R-17菌株的荧光表达Fig.1ExpressionoffluorescentproteinintransformantsVD07038G-10andBp2R-17遥通过对转化子胞外分泌纤维素酶和果胶酶的能力进行检测袁发现4个转化子胞外分泌酶的产生和利用情况与野生型基本一致遥转化子致病力检测通过灌根的方法检测4个转化子VD07038G-10尧VD07038G-9尧Bp2R-17尧Bp2R-30对感黄萎病菌的棉花

22、品种苏棉22的致病情况袁1院PCL-sGFP质粒曰2院转化子VD07038G-10曰3院VD07038G-9曰4院VD07038-WT曰5院Bp2R-17曰6院Bp2R-30曰7院Bp2-WT曰8院PCL-mCherryRFP质粒曰H院无菌水曰M院2000bpMarker遥1:PlasmidPCL-sGFP;2:TransformantVD07038G-10;3:TransformantVD07038G-9;4:WildtypeVD07038;5:Trans-formantBp2R-17;6:TransformantBp2R-30;7:WildtypeBp2;8:PlasmidPCL-mChe

23、rryRFP;H:Sterilewater;M:2000bpMarker.图2转化子中潮霉素基因的PCR检测Fig.2DNAamplificationwiththeprimersspecificforgenesfromtransformants2243期表1转化子的产孢量考察Table1Sporulationquantityoftransformants图3转化子的生长速率检测Fig.3Thegrowthrateoftransformants发现落叶型黄萎病菌VD07038及其转化子的致病能力要显著高于非落叶型黄萎病菌Bp2及其转化子遥含基因的转化子VD07038G-10尧VD07038G-9

24、及含基因的转化子Bp2R-17致病力与野生型菌株基本一致袁都可以使棉花产生严重的坏死袁叶片萎蔫袁根部变褐袁而转化子Bp2R-30的致病力明显下降渊表2冤遥GFP标记的黄萎病菌的侵染使用浓度为4伊106mL-1的VD07038G-10的孢子悬浮液对苏棉22进行蘸根处理袁接种12h后观察到VD07038G-10的孢子可以吸附在根部的任何位置袁且孢子随机分布袁但不同部位的孢子量有多有少渊图1e冤遥接种3d后袁棉花根部表面出现复杂的菌丝网络袁覆盖在主根上袁接着孢子萌发进入根内部遥接种5d后袁可以观察到棉花黄萎病菌的孢子在根的皮层内进行扩展(图1f)袁此时60%的苏棉22的根部都出现褐色的病症遥接种79

25、d后袁菌丝开始入侵到棉花主根部的维管组织遥接菌14d后袁75%的苏棉22的根部出现黑色的病斑袁叶片出现萎蔫尧枯黄的症状遥注院同一列中a,b,c表示处理间在0.05水平上的差异显著遥Note:Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.菌株Strains产孢量Sporulationquantity(伊106)1d2d3d4d5d6d7dVD07038-WT2.73依0.45b160.33依1.49a304.33依5.67a366.33依28.92a336.67依10.14a332.66依18.22a357.66依4.33aVD07038G-102.61依0.51

26、b192.00依2.64a289.60依14.24a354.66依21.31a328.67依14.85a320.33依18.94ab356.00依2.08aVD07038G-92.67依0.41b175.86依1.25a306.70依9.42a359.16依4.41a332.80依12.5a326.30依5.2ab356.70依1.12aBp2-WT4.00依0.29a62.00依0.29b198.66依0.67b252.00依3.06b287.66依10.27b303.66依2.33ab261.33依9.27bBp2R-173.60依0.33ab57.33依0.33b206.66依3.31b

27、246.00依4.93b271.66依1.67b293.66依6.98b254.33依2.96bBp2R-301.17依0.17c8.50依0.29c76.67依1.67c83.33依1.67c76.67依1.67c75.83依2.20c55.00依1.44c表2野生型及转化子的致病力调查Table2Pathogenicitytestofwildtypeandtransformants注院同一列中a,b,c表示处理间在0.05水平上的差异显著遥Note:Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.菌株Strains病情指数Diseaseindex2周Twowe

28、eks3周Threeweeks4周Fourweeks5周FiveweeksVD07038-WT11.25a22.50a43.75a51.25aVD07038G-1010.00a20.00a45.00a51.25aVD07038G-98.75ab18.75ab43.75a50.00aBp2-WT5.00b15.00b35.00b40.00bBp2R-175.00b15.00b33.75b42.50bBp2R-300.00c3.75c21.25c26.67c王晓楠等院荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育225棉花学报26卷讨论农杆菌介导的遗传转化由于具有受体材料范围广尧转化效率高尧转化子能够

29、稳定遗传等优点而被广泛应用于丝状真菌的研究遥2004年Dobinson等利用农杆菌介导的定点突变的方法得到了大丽轮枝菌1(胰蛋白酶)基因的突变体袁证明了农杆菌介导的转化方法可以用于大丽轮枝菌的遗传转化和基因定点突变18遥Eynck等采用农杆菌介导法将pGV04载体成功地转入大丽轮枝菌袁获得了稳定表达GFP的大量转化子19遥本研究通过农杆菌介导的孢子转化系统将绿色荧光蛋白基因导入落叶型黄萎病菌VD07038袁将红色荧光蛋白基因非落叶型黄萎病菌导入Bp2袁成功获得了携带有相应荧光蛋白基因的转化子遥本研究进一步说明这种转化方法是有效的遥研究表明T-DNA整合到黄萎病菌基因组上时袁其插入位点是随机的袁

30、而插入位点的不同可能会影响转化子的生长速度尧菌落形态和菌落颜色尧微菌核产生等性状16,20遥对所有转化子的菌落形态进行观察袁发现部分转化子菌落形态异常袁产微菌核能力下降甚至不能产生微菌核遥黄萎病菌的微菌核是由单根或数根菌丝经分隔膨大尧胞壁增厚并多向芽殖而形成的多细胞结构袁可以在没有寄主存在的条件下在土壤中存活20年以上遥已经证明稻瘟病微菌核与致病力存在一定关系21-22遥本研究中的转化子Bp2R-30产微菌核能力消失袁与野生型菌株相比致病力显著下降袁从而说明棉花黄萎病菌的致病力与微菌核的产生可能存在一定程度正相关性袁这与田秀明23尧徐荣旗等24的研究是一致的遥通过对转化子的生长速度和产孢量进行

31、考察袁发现大部分转化子生长速度和产孢量与野生型基本一致袁少量转化子发生变异袁生长速度下降袁产孢量高于或低于初始菌株袁并且与野生型相比产孢高峰提早或推迟遥这些表型的变异很可能是由T-DNA的插入破坏基因表达所导致的遥因此袁这些突变体是后期研究黄萎病菌基因功能的宝贵材料遥本研究表明通过农杆菌介导法可以将荧光蛋白基因转入棉花黄萎病菌袁并且筛选出了带有荧光标记而致病力与野生型菌株无差异的转基因菌株遥这些菌株可以用于棉花对黄萎病的抗性鉴定遥棉花品种对黄萎病的抗性鉴定通常在人工接种的病圃或自然病圃进行袁根据发病率和病指确定品种的抗性水平遥人工病圃或自然发病田块诱发筛选抗病或耐病的品种资源袁都需要一个适宜发

32、病的环境条件和发病过程袁因此抗性鉴定结果易受到天气及土壤条件的影响袁导致年份尧地区间鉴定结果的差异袁也难以观察病菌的侵染过程遥研究更为准确的鉴定方法很有必要遥VD07038菌系是国家棉花区域试验中进行黄萎病抗性鉴定采用的菌系袁作者将绿色荧光蛋白转入VD07038菌系袁并利用标记的VD07038G-10转化子袁观察了黄萎病菌对感病品种苏棉22的侵染袁发现接菌12h后VD07038G-10的孢子随机分布在根表面曰接种79d后袁菌丝开始入侵到棉花主根部的维管组织曰接菌14d后袁出现根部变褐袁叶片萎蔫尧枯黄的症状曰上述结果与Val-lad等25和Zhang等26的研究一致遥说明所获得的转绿色荧光蛋白基

33、因的VD07038菌系可以用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的动态过程袁并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性袁根据荧光强度确定抗性水平袁使抗性鉴定结果更准确遥本研究结果为棉花黄萎病抗性鉴定提供了一种新的方法遥致谢院感谢中国农业科学院棉花研究所朱荷琴研究员为本实验提供了落叶型黄萎病菌菌系VD07038袁感谢江苏省农业科学院植物保护研究所林玲研究员提供非落叶型菌系Bp2遥参考文献院1KlostermanSJ,AtallahZK,ValladGE,etal.Diversity,pathogenicity,andmanagementofspeciesJ.Annu-alReviewofPhytopa

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