动物细胞工程

1、细胞工程试卷 满分 100分 考试时间：120 分钟 专业： 姓名： 学号： 任课教师： 题号一二三四五总分得分 1、 名词解释（6 小题，每题 3 分，共 18 分）1. cell line : 2. 接触抑制: 3.monoclone antibody: 4.转基因： 5.Karyoplast ： 6.生物技术： 2、 填空题（20 空，每空 1 分，共 20 分）1. .细胞培养环境的无污染主要包括： , 和 。2. 细胞与组织培养技术就是从动物或植物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内的 ，在 ,适温和 下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术. 3. 在动物细胞体外培养

2、中，除必须有的培养基外，还要使用包括 、 、 和 等细胞培养用液。 4. 细胞融合的基本过程包括细胞的接触， ，细胞质的渗透和 。5.体外培养的动物细胞，按照其生长方式可以分为 和 。6.根据受体细胞的不同和基因导入方式的区别，可以将转基因动物的制备方法分为 ， ，反转录病毒感染法和精子载体导入法。 7.克隆动物的方法根据不同来源的供体细胞核移植来实现，有胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞和成体细胞 的应用最普遍 的意义最大。8.细胞重组技术又被称为细胞拆合技术，就是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在 将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其 成为具有生物活性的细胞的一种实验技术过程。 3、

3、是非题（10 小题，每题 1 分，共 10 分）1.对悬浮生长的细胞，如白血病细胞、骨髓细胞和腹水瘤细胞等可不经过消化直接离心分离收集。 2.PEG诱导法与电融合法的比较具有操作简单，融合效率高而且稳定，细胞的需要量小的特点。 3.细胞重组的方式基本分为三种：胞质杂种细胞，重组细胞和微细胞异核体，其中胞质体与完整细胞重组形成重组细胞。 4. 由传代培养产生的能继续进行传代培养的细胞群体称为细胞株。 5.无血清培养基一般由两个部分构成基础培养基（合成培养基）和补充因子。 6.细胞冻存与复苏的基本原则是快冻慢融。 7.转基因动物研制中， 外源基因表达效率低和遗传丢失是存在的主要问题。 8. 克隆动

4、物等技术尚不成熟，还处于探索阶段。目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。 9.DNA重组技术的建立是现代生物技术的标志。 10. 在实际贴壁细胞培养中，所培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态形式，而多呈现的是一些过渡性形态。 4. 简答题（5 小题，每题 5 分，共 25 分）1. 简要说明体外培养细胞重要的生长特点包括什么？并说明其过程或机理。 2. 细胞与组织体外培养的类型有哪些？并说明其概念。 3.何为细胞融合技术，且动物细胞融合的基本原理是什么？ 4.简述转基因的类型有哪些，并说明其不同 。 5.利用动物细胞重组技术进行动物克隆的理论基础。 五综合分析题。1.无菌技术是体外培

5、养细胞过程中首要而且绝对重要的部分，请根据你所学到的知识与实际操作中遇到的问题谈谈怎样做到无菌操作。 2. 某公司需要你用杂交瘤技术大量制备单克隆抗体，根据你所学的理论知识与实际的实验操作阐述你将按怎样的步骤实行该计划？ 参考答案2、 名词解释（6 小题，每题 3 分，共 18 分）1. 细胞系/cell line : 由初代培养产生的能继续进行传代培养的细胞群体称为细胞系。2. 接触抑制/contact inhibition : 当贴壁细胞长满底物时，一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动将停止，此即接触抑制。 3. 单克隆抗体/ monoc

6、lone antibody : 指由单个B细胞克隆产生的针对于一个抗原的一个抗原决定簇（表位）的均一性抗体。4. 转基因/ transgene : 又被称为基因转移，就是指借助于物理、化学或生物的手段将外源基因导入受体细胞，并检查其在该细胞内表达情况的一种技术。5. 核体/Karyoplast : 与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜的结构。6.生物技术/biotechnology : 指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的技术原理与过程。有时也称为生物工程。3、

7、填空题（20 空，每空 1 分，共 20 分）2. .细胞培养环境的无污染主要包括：无微生物污染 ，无其他细胞污染 和无毒性物质污染。 3. 细胞与组织培养技术就是从动物或植物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内的 生理环境 ，在 无菌 ,适温和 丰富的营养物质 下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术. 4. 在动物细胞体外培养中，除必须有的培养基外，还要使用包括 缓冲液 、 平衡盐溶液 、 消化液 和 抗生素液 等细胞培养用液。 5. 细胞融合的基本过程包括细胞的接触，细胞质膜的融合 ，细胞质的渗透和遗传物质的选择与融合 。6.体外培养的动物细胞，按照其生长方式可以分为 贴壁

8、生长型细胞 和 悬浮生长型细胞 。5. 根据受体细胞的不同和基因导入方式的区别，可以将转基因动物的制备方法分为显微注射法受精卵雄核 ， 导入胚胎干细胞 ，反转录病毒感染法和精子载体导入法。7 克隆动物的方法根据不同来源的供体细胞核移植来实现，有胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞和成体细胞 胚胎细胞克隆 的应用最普遍 体细胞克隆 的意义最大。 8 .细胞重组技术又被称为细胞拆合技术，就是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在 在体外一定条件下 将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其 重新装配 成为具有生物活性的细胞的一种实验技术过程。 4、 是非题（10 小题，每题 1 分，共 10 分）1. 对

9、悬浮生长的细胞，如白血病细胞、骨髓细胞和腹水瘤细胞等可不经过消化直接离心分 离收集。 （ 对 ） 2. PEG诱导法与电融合法的比较具有操作简单，融合效率高而且稳定，细胞的需要量小 的特点。 （ 错 ） 3.细胞重组的方式基本分为三种：胞质杂种细胞，重组细胞和微细胞异核体，其中胞质体 与完整细胞重组形成 重组细胞 （ 错 ） 4. 由传代培养产生的能继续进行传代培养的细胞群体称为细胞株。 （ 错 ）5. 无血清培养基一般由两个部分构成基础培养基（合成培养基）和补充因子。 （ 对 ） 6. 细胞冻存与复苏的基本原则是快冻慢融。 （ 错 ） 7. 转基因动物研制中， 外源基因表达效率低和遗传丢失是

10、存在的主要问题。 （ 对 ）8. 克隆动物等技术尚不成熟，还处于探索阶段。目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性 和随机性。 （ 对 ）9.DNA重组技术的建立是现代生物技术的标志。 （ 对 ） 10. 在实际贴壁细胞培养中，所培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态形式，而多呈现 的是一些过渡性形态 （对 ）4、 简答题（5 小题，每题 5 分，共 25 分） 1.简要说明体外培养细胞重要的生长特点包括什么？并说明其过程或机理。第一点：贴附与伸展 大多数的哺乳动物细胞在体外均附着于一定的底物而生长。当培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤

11、维细胞样或上皮细胞样等。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长时期在悬浮中生长，除非是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。第二点：运动的接触抑制与生长的密度抑制，一般情况下，正常细胞在不断分裂而增殖的过程中存在不停顿的活动或移动，其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动，但是，当两个细胞移动而互相靠近时，其中之一或两个将停止移动并向另一方向离开，这保证了细胞将不会重叠。当贴壁细胞长满底物时，一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动将停止，此即接触抑制。一般来说，当细胞生长、汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，扁平形成的程度减小，与培养液接触的表

12、面积减少；同时培养液中的一些营养物将逐渐消耗掉，尤其是细胞周围的部位，因此，这种形成的单层细胞，其分裂将停止，单层细胞的密度常与培养液中的血清浓度有关，这种贴壁细胞的体外生长特性被称为细胞生长的密度抑制。形成密度抑制的单层细胞可在静止状态维持存活一段时间，但不发生分裂增殖。转化细胞和恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，它们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长成较高的终末细胞密度。2. 细胞与组织体外培养的类型有哪些？并说明其概念。 答.细胞与组织体外培养类型有原代培养和传代培养。将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程称为原代培养，一般实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。从原代

13、培养的细胞继续转接培养称为传代培养。3.何为细胞融合技术，且动物细胞融合的基本原理是什么？细胞融合技术就是在细胞融合现象的基础上，使用人工操作，将不同来源的原生质体（除去细胞壁的细胞）相融合并使之分化、再生、形成新物种或获得新产品的技术过程。因此，细胞融合技术也被称为体细胞杂交。动物细胞融合的细胞膜基础是细胞膜的结构和流动性是动物细胞融合的生物学基础。细胞融合过程中细胞膜结构的变化与融合在动物细胞融合的过程中，两个细胞膜从彼此靠近、接触到破裂形成细胞桥，最后重排并完成细胞质和细胞核的渗透融合；其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步；许多生物的、化学的和物理的因素，能够诱导细胞膜的脂类分子的有序

14、排列发生改变，从而加速细胞桥的形成；当诱导因素解除后，细胞膜重排恢复有序结构，而发生细胞的融合。4. 简述转基因的类型有哪些，并说明其不同 。 暂时转染（瞬时转染）：包含目的基因的质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，并不进入细胞基因组，多用于考查基因的表达情况以及人和动物的基因治疗；永久性转染：基因整合入细胞基因组，产生永久有效的转染；用于改造物种。5.利用动物细胞重组技术进行动物克隆的理论基础。 细胞的全能性 已经分化了和尚未分化的细胞具有发育成完整有机体的各种组织的潜在能力的性质。细胞的全能性与细胞机能的特化，微生物等单细胞生物的细胞保持了“全能”,细胞各种技能稳定；而高等生物细胞则牺牲“全

15、能”，而提高某种功能的效率，细胞出现分化，但是任何一个细胞都还含有其生物体基因组的全部基因，因此都能被克隆。植物细胞易于克隆，用一个胡萝卜细胞在试管中培养，能长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株，由此开发的植物的组织培养，证明了植物细胞全能性；“动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰？”；1930s，斯佩尔曼提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎的发育？”；早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体胚胎细胞具有全能性；“多利”羊的克隆出世高度分化的动物细胞核仍具有全能性。 五综合分析题。 1.无菌技术是体外培养细胞过程中首要而且绝对重要的部分，请根据你所学到的知识与

16、实际操作中遇到的问题谈谈怎样做到无菌操作。答：细胞培养中的无菌操作技术的要点包括以下几部分：I. 培养前准备：在实验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好；根据实验要求，准备各种所需的器材和物品，消毒后放入培养室； II. 培养室和超净工作台的消毒：无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭（苯扎溴铵）脱洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒3050min；超净工作台台面每次实验前要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦洗，然后用紫外线消毒30min。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。注意：消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，

17、否则会遮挡射线，降低消毒效果；在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。III. 洗手和着装：进入无菌培养室原则上必须彻底洗手并按外科手术要求着装，无菌服、帽子和口罩每次实验后都要清洗消毒；开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁尔灭消毒手或前臂；如果实验过程中触及可能污染的物品或出入培养室都要重新用消毒液洗手。平时仅做观察不做培养操作时，可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。 IV. 无菌培养操作：细胞培养应在超净工作台里进行，一切操作都应在火焰近处经烧灼进行；尽量避免使用先前已打开消毒包装的物品；培养用液或其他消毒后物品不应在工作区以外打开；培养液开放操作时，应避免衣袖

18、或其他非无菌物品的细菌掉落到培养液中；在超净工作台中，应每次进行一种细胞系的操作，不同的细胞系应使用各自单独的培养液，以避免细胞系的交叉污染；超净工作台在实验完毕后，应尽可能的减少物品堆放，并用适当的消毒液擦洗台面；培养箱定期进行消毒处理；在培养过程中进行细胞的常规检查监测。总的来讲包括3大部分：工作环境及表面的无菌；细胞培养用品与培养用液的无菌处理；实验者的无菌操作。2. 某公司需要你用杂交瘤技术大量制备单克隆抗体，根据你所学的理论知识与实际的实验操作阐述你将按怎样的步骤实行该计划？A.动物的免疫与免疫脾细胞悬液的制备免疫动物应和骨髓瘤细胞系属于同一品系（一般用Balb/c小鼠）三次皮下多点

19、的基础免疫（与CFA混合首次免疫、与IFA混合的第二和第三次免疫）融合前3天，进行加强免疫（无佐剂，脾内注射）脱劲处死小鼠，取脾脏，机械法消化，制备脾细胞悬液，细胞计数。B.小鼠骨髓瘤细胞的培养 ：最常用的骨髓瘤细胞系为来自Balb/C小鼠的NS-1和SP2/0细胞系，它们均不分泌免疫球蛋白，在代谢方面均为HGPRT缺陷性，因此在HAT培养基中不能生长；复苏细胞后，传代培养，每35天传代一次，最大密度不得超过106个/ml；一般在融合前的两周开始复苏，融合时保证细胞处于对数生长期和良好的形态，活细胞计数应高于95%。C.饲养层细胞的制备脱劲处死小鼠，75%酒精浸泡2min；剪开小鼠腹腔，基础培

20、养液或无菌的PBS反复冲洗腹腔；收集冲洗液，离心，弃上清；用HAT培养液稀释沉淀细胞，细胞计数，调整细胞密度（一般为1×105个/ml）；将细胞悬液按0.1ml/孔加到96孔培养板中，培养过夜，备用D.免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合（PEG诱导法）将处于对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合（1:5或1:10）离心，弃上清，并吸净残留液；用吸管在1min内向细胞沉淀滴加40%50%的PEG（0.51ml）,均匀混合，室温静置12min；加入37预温的完全培养液，终止PEG作用离心，弃上清，用含20%的FCS的完全培养液轻轻的悬浮细胞，接种于96孔培养板， 37培养。E.杂交瘤细胞的HA

21、T选择融合24h后，在培养板中加入HAT选择培养液，每隔3天更换1/2HAT选择培养液，两周后改用HT选择培养液培养；于选择培养后3天，开始观察细胞的生长情况，杂交瘤细胞一般在36天开始形成克隆集落，而未融合的细胞在57天后逐渐死亡。.F.抗体的检测;一次成功的融合可以获得数以百计的杂交瘤细胞集落，其中仅有少数集落能分泌针对免疫原的特异性抗体。要判断其中哪些集落是实验所需要的、能分泌特异性抗体的克隆，就必须对杂交瘤细胞生长孔内的上清液进行抗体测定，找到可以分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。常用的检测抗体的方法有ELISA、RIA、荧光检测和免疫组化G.I. 杂交瘤细胞的克隆化培养,在筛选出的含有阳性上清液的培养孔中