hplc方法测胆汁酸含量方法汇总

1、HPLC 方法测胆汁酸含量方法汇总一、 反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸（ 一 ） 试验仪器Ardent LC-1100 高效液相色谱仪，附荧光检测器（A gilent 公司，美国）;Waters Nova C18 色谱柱（X 150 mm, 5l.仙 m） （ Waters 公司美国）， 保护柱及C18柱芯（Phenomenme公司美国）；ChromabondC18固相萃取小柱 （M acherey- Nagel） 公司德国）。（ 二 ） 试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素（BM C）、18-冠醴-6（DCC） , a -鼠胆酸 （a -MCA） , B -鼠胆酸（B -M

2、CA）、熊脱氧胆酸（U DCA）、胆酸（CA）、猪脱氧 胆酸（H DCA ）、脱氧胆酸（DCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA甘氨胆酸（GCA）、甘氨 鹅脱氧胆酸（GCDC躯准品及胆猷甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。甲醇、乙睛 （ 色谱纯，美国天地公司） ，月桂酸 （ 分析纯，上海化学试剂公司） ，氢氧化钾、磷酸二氢钾（ 分析纯，成都化学试剂厂）.（ 三 ） 色谱条件流动相:A相，甲醇：乙睛为1:2（ V/V） ; B相，超纯水；梯度洗脱程序：65%A （08min） , 80%A（816 min）, 90%A（1620 min）;柱温：20 C;流速：1 mL/ min;激发波长:330n

3、m；发射波长：400nm（ 四 ） 样品处理样品预处理：取鼠胆汁20仙L,加入120仙mol/L月桂酸甲醇液 50 nL,再加入乙睛2 mL,充分混匀,超声 20 min, 10 000 g 离心10 min, 取上清液，在60氮气下吹干。胆汁酸的提取: 测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL L 磷酸盐缓冲液（pH 7） ，加至已活化的固相萃取C18小柱上（用2 mL甲醇和5 mL蒸储水依次活化 C18小柱），再用10 mL 蒸储水淋洗小柱，最后用 3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时， 向预处理吹干后的胆汁样品中加入 1 mg胆酥甘氨酸水解酶，再加入0.

4、 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液（pH mL,避光37c反应30 min ,再加入mol/ L磷 酸盐缓冲液（pH 7） 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取 C18小柱上， 其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸.胆汁酸的衍生与测定：向胆汁酸洗脱液中加入150 n L 1. 8 mmol/ L KOH?醇7于60 C氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BMC乙睛液与5 mmol/ LDCJ睛7各50仙L,密闭，37c条件下反应30min,取10仙L进样分析.高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸（一）试验仪器AP I 2000质谱仪（加拿大 A pplied Bi

5、osystens 公司），配备 Perk in E Inmer 200 泵和 tubro 离子源;A tlantisdC色谱柱，150 mm X mm,5（im（美国 Waters公司），保护柱及C18柱芯（美国Phenan enex公司），Chrcm abond C18 ec （ 3 mL/200 m g 德国 M achere-N agel 公司），M illpore 纯水装置（美it M川pore 公司）。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱 纯（Sigma公司）；甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯（美国Tedia公司）。（二）试验试剂15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯（Sigma公司）；甲醇、

6、乙睛和 甲酸均为色谱纯（美国Tedia公司）。（三）色谱条件柱温:25;流速：1 m L /min 分流比为1:4;流动相A: 5 mm o 1/L 醋酸钱和%酸水?§液；B: 5 mm o 1/L醋酸钱和0 O1%P酸甲醇溶液。梯 度洗脱程序为：Omin （80% B） 9min% B） 10 m in （ 80% B） 15 m in （80 % B ） o（四）样品处理蛋白沉淀法：800乙睛中加入300 L血清，混匀1 min,超声 30min以15000 X g离心15min,取900 L上清液60c氮气吹干，其余同 周相萃取。周相萃取法：依次用1 mL甲醇,甲酸溶液活化固相

7、萃取小柱。1 mL% 甲酸溶液中加入30O（i L血清，混匀1 min后上小柱。依次用1 m L %甲 酸溶液、1 mL甲醇水溶液（45: 55,V /V）冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于 100 流动相（A: B= 20: 80 , V/V）中，漩涡混匀lmin超声2min。取 20 nL进行H PLC-MSIM的析，检测时间15min。3、 高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸（一）试验仪器Shimadzu 2010LC- AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器（日本Shimadzu公司）;Aglient 固相萃取装置（

8、美国 Aglient 公 司）;Millipore纯水装置（美国 Millipore公司）；Chromabond C18固相萃取小柱（彳惠国Maeherey- Nagel公司）；牛磺熊脱氧胆酸 CTauroursodeoxycholic acid TUDCA）、牛磺胆酸（CTaurocholic acid TCA）、甘 氨胆酸（Glycocholic acid,GCA）、甘氨 石胆酸 （Glycol-ithochdic acid, GLCA） 、甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholic acid,GDCA）牛磺脱氧胆酸（CTaurodeoxycholic acid TDCA）、甘氨鹅脱

9、氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid GCDCA）、牛磺鹅脱氧胆酸门， aurochenodeoxycholic acid, TCDCA） 牛磺石胆酸 CTaurolithocholic acid TLCA）标准品均购自美国sigma公司；甲醇、乙睛（色谱纯，美国 Tedia公司），其余试剂均为分析纯。（二）试验试剂牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCAA）牛磺胆酸 （CTaurocholic acid TCA） 、甘氨胆酸（Glycocholic acid,GCA） 、甘氨石 胆 酸 （Glycol-ithochdic acid

10、, GLCA） 、 甘 氨 脱 氧 胆 酸 （Glycodeoxycholic acid,GDCA） 牛 磺 脱 氧 胆 酸 （CTaurodeoxycholic acid TDCA） 、甘氨鹅脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid GCDCA） 、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholic acid, TCDCA） 、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid TLCA标准品均贝自美国sigma公司；甲醇、 乙睛 （ 色谱纯，美国Tedia 公司 ） ，其余试剂均为分析纯。（ 三 ） 色谱条件谱柱为 Waters Nova C18柱 mm

11、x 150mm, 5仙m）,流动相为甲醇 一 60 mmol/L磷酸盐缓冲液（66:34,v/v） ,pH ,等度洗脱，柱温25 C, 流速：ml/min;检测波长：197 nm ,进样量为10仙L。（ 四 ） 样品处理方法1:取胆汁样品25仙L,加入乙睛ml ,旋涡震荡混匀，超声20 min,10 000g/min 离心10min,取上清液2 ml, 60 C氮气下吹干。将预 处理吹干后的汁样品溶于2 ml mol/L 磷酸盐缓冲液（pH ，加至己活化的固相萃取C18小柱上（预先用2 ml甲醇和5 ml蒸储水依次活化C18 小柱 ） ，再用 10 ml 蒸馏水淋洗小柱，最后用3 ml 甲醇洗

12、脱胆汁酸。洗脱液在60c氮气下吹干后溶于200 流动相，超声30 s,lO nL进 样。4、 血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定（ 一 ） 试验仪器1100 型高效液相色谱- 质谱联用仪（Agilen t 公司 ），配备四元梯度泵，100 位自动进样器，荧光检测器，在线真空脱气机，大气压化学电离源（APCI）; H ypersil C 18色谱柱 mm X 200 mm, 5仙m,中国科学院大连化学物理研究所） 。 1, 2-: 苯并 -3,4- 二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯 （ 自制 ）; 胆汁酸标准样品（Sigma 公司 ）; 无水乙睛 （禹城化学试剂厂 ） ，用P2O5 干燥

13、后蒸馏处理，二甲基亚矾经减压蒸馏后备用; 柠檬酸钾、 酒石酸钠等均为分析纯，实验用水由Milli-Q 超纯水系统制备。（ 二 ） 试验试剂标准溶液的配制：准确称取定量胆汁酸标准品，用乙睛配成L 的溶液。称取m g 的 1, 2-: 苯并 -3,4 二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯（BDETS）用二甲基亚矶定容至l Om L,浓度为mo1/L。相应低浓度的衍生试剂（500仙mol/L）标准溶液用二甲基亚矶稀释， 低浓度胆汁酸（50Nmol/L）标准溶液用无水乙睛稀释而成。（ 三 ） 色谱条件色谱柱:H ypersil C18色谱柱 mmX 200 mm,5m ）。流动 A: 50%乙睛水溶液（含有

14、 40 mm o 1/L 的 HCOON4,HpH = ; B: 100% 的乙睛。梯度洗脱程序为（0%B 35 min线性梯度到70%B到40 min线性梯度到 10（plo B, 100%B 再运行15min流速为min柱温300C。荧光激发波长 和发射波长分别为：入ex = 333 nm,入em=390 nm.质谱条件:1100 型高效液相色谱领谱联用仪; 大气压化学电离源（APC I） ，正离子模式，喷雾压力M Pa; 干燥气流量为5 L /min 燥气温度350C,气化温度450C;毛细管电压3500V,电晕电流4000nA（ 四 ） 样品处理标准品的衍生过程：盛有500 m g 柠

15、檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DM S0, 50混合胆汁酸溶液，150仙L衍生试剂溶液，封口后于95c恒温水浴下振荡反应30min取出放冷后加入300 乙睛混合均匀，取上层溶液用乙睛水溶液（CH3CN /H20, 1:1, V/V） 稀释5 倍直接进样分析。血清中胆汁酸的提取：向盛有2 mL清样品的离心试管中加入3 mL 甲醇并振荡摇匀，然后加入硫酸按固体超声振荡，离心后取出有机相用氮气吹干，剩余物用300 mL DM SO溶解后加入mL水。然后用经过 4m L甲醇和5m L水冲洗的。8 Sep-Pak萃取柱过滤，再用5 mL水冲洗 萃取柱，然后用5 mL乙睛将胆汁酸洗脱，将洗脱

16、液挥发至干用300 mLDMSO解冷藏备用。五、 柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中9 种胆汁（ 一 ） 试验仪器LC-6A高效液相色谱仪，RF-535荧光检测器（日本，岛津公司）；玻 璃管均硅烷化。（ 二 ） 试验试剂胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA熊脱氧胆酸 （U DCA）、石胆酸（LCA）、甘氨胆酸（GCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）甘 氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）甘氨石胆酸（GLCA） （ Sigma aldrich 公司）。 BM C（4-澳甲基-7-甲氧基香豆素）,DCC（18-冠醴-6） （ Sigma aldrich 公司 ） ，甲醇、乙睛（ 色谱纯，美国天地公司） ，氢氧化钾、磷酸二氢钾、月桂酸均为国产分析纯。（ 三 ） 色谱条件Waters Nova C18 色谱柱 X 150 mm, 5 仙 m）。柱温 25 C。荧光检 测：激发波长330 nm,荧光波长410 nm。流动相A:三蒸水；流动相B: 乙睛：甲醇=2: 1（ V/V）,流速1 mL/ min,梯度洗脱程序:0. 0 min,65% B; 8. 0 min, 65% B; min, 80% B; min, 80% B; 19 min, 90% B; 24 min, 90% B 。以月桂酸为内标定量。（ 四 ） 样品处理将40仙mol/L内标液50加至U 250仙