2015版中国药典微生物检验规程

1、2015版中国药典微生物检验规 程微生物检验规程1 .实验注意事项1.1 无菌操作要求1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作 帽。1.1.2 专用的工作服、帽及拖鞋，应放在 无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使 用。1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥 皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干 净。1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养 基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完 的器皿，不能放置后再使用，金属用具应 高压灭菌或用 95%酉精点燃烧灼三次后 使用。1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不 能触及外露部位，使用吸管接种于试管或 平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。1.1.6

2、 接种样品、转种细菌必须在酒精灯 旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装 中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都 要通过火焰消毒。1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火 焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和 针与杆的连接处。1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应 的橡皮头吸取，不得直接用口吸。1.2 无菌间使用要求1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用 消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放 与实验无关的物品。1.2.2 无菌间使用前后应将门关紧，打开 紫外灯，照射时间不少于30min,使用紫 外灯，应注意不得直接在紫外线下操作， 以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉 球轻轻擦拭，除去上面灰

3、尘和油垢，以减 少紫外线穿透的影响。1.2.3 处理和接种样品时，进入无菌间操 作，不得随意出入，如需要传递物品，可 通过小窗传递。1.3 消毒灭菌要求1.3.1 灭菌前准备(1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾 干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒 应将上面通气孔打开。(2)装培养基的三角瓶，内容物不应超 过总体积的2/3 (例如500mL的三角瓶最 好装300350mL培养基，以防再次加热 融化时爆沸)。(3)无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用 纸包裹，进行湿热灭菌。1.3.2 装放(1)干热灭菌器：装放物品不可过挤， 且不能接触箱的四壁。(2)大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分 别包扎好，直接放入

4、消毒筒内，物品之间 不能过挤。1.3.3 设备检查(1)检查门的开关是否灵活，橡皮圈有 无损坏，是否平整。(2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在 零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观 察是否漏气，压力表与温度计所标示的状 况是否吻合，管道有无堵塞。(3)对有自动电子程序控制装置的灭菌 器，使用前应检查规定的程序，是否符合 于进行灭菌处理的要求。1.3.4 灭菌处理(1)干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制 品、陶瓷制品等的灭菌。灭菌完毕后或温 度升温过程中，须在 60 c以下才能打开 箱门。(2)立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到 零时，自然冷却至60 c后开盖取物，如 为液体物品，不要打开排气阀，而

5、应立即 将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至 零，温度降到60 c以下 再开盖取物，以 防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。(3)物品取出，随即检查包装的完整性， 若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸 者，不可作为无菌物品使用。培养基或试 剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽 或状态，未达到者应废弃。取出的物品掉 落在地或误放不洁处，或沾有水液，均视 为受到污染，不可作为无菌物品使用。取 出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防 尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。凡属合 格物品，应标有灭菌日期及有效期限。1.4 有毒有菌污物处理要求1.4.1 经培养的污染材料及废弃物应放 在严密的容器或铁丝筐内，并集中

6、存放在 指定地点，待统一进行高压灭菌（经微生 物污染的培养物，必须经121c 30min高 压灭菌）。1.4.2 染菌后的吸管（即进行阳性菌操作 后的），使用后放入5 %煤酚皂溶液或石 炭酸液中，最少浸泡24h （消毒液体不得 低于浸泡的高度）再经121 C 30 min高压 灭菌。1.4.3 涂片染色冲洗片的液体，一般可直 接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲 在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水 道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸 泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的 玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。1.4.4 打碎的培养物，立即用5%煤酚皂 溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位, 浸泡半

7、小时后再擦拭干净。1.4.5 污染的工作服或进行强致病菌试 验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专 用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗 涤。1.5 培养基制备要求1.5.1 根据培养基配方的成分按量称取 （可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸储水中，在使用前对应用的试 剂药品应进行质量检验。1.5.2 因高压灭菌可影响一些培养基的 PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或 次数太多，以免影响培养基的质量。1.5.3 盛装培养基不宜用铁、铜等容器， 使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧 瓶）为好。1.5.4 每批培养基制备好后，应做无菌生 长试验（空白平皿试验）及所检菌株生长 试验。如果是生化培养基

8、，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常 反应，培养基不应贮存过久，必要时可置 4 c冰箱存放。2 .实验操作2.1 准备用具，配制培养基、稀释液、培 养箱2.1.1 用具：150mLH角烧瓶 试管1mL 移液管10mL移液管2.1.2 培养基：需氧菌菌总数 胰酪大豆陈琼脂培养基、霉菌和酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基控 制 菌 胰酪大豆豚液体培养基肠道菌增菌液体培养基康凯液体培养基RV沙门增菌液体培养基接 种 平 板紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基麦康凯琼脂培养基木 糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基2.1.3 稀释液：0. 9%无菌氯化钠溶液2.1.4 培养箱：3 个（30? 35C、20? 2

9、5C、42? 44 C）2.2 培养基配制2.3 灭菌2.4 无菌检查：将灭菌的培养基放入 37 C 的温室中培养24至48小时，以检查灭菌 是否彻底。2.5 无菌室准备：用消毒液擦拭无菌室， 将本次试验所用的器皿、培养基通过传递 窗送到无菌室，样品置于传递窗，一次 性使用物料（工作服、口罩、手套）置于 缓冲间。开启净化系统1小时，关闭净化 系统，打开紫外灯0.5小时，关闭紫外灯， 至少0.5小时后进入无菌室。2.6 微生物计数检验（平皿倾注法）2.6.1 供试液制备2.6.1.1 称取样品：一般供试品的检验量 为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药 品、微量包装药品的检验量可以酌减。

10、检 验时，应从2个以上最小包装单位中抽 取供试品，大蜜丸还不得少于 4丸，膜 剂还不得少于4片。2.6.1.2 稀释液制备：0. 9%无菌氯化钠 溶液2.6.2 平皿的制备：3个稀释级（常用10-1、 10-2、10-3）（每稀释级每种培养基至少制 备2个平板），同时做空白（等量稀释剂）供试液用量为适应性试验确定的，常用 1ml32.6.3 加入培养基：取培养基，融化并让 其冷却至45c左右，倾入已加入供试液 的平皿中，每个平皿约15mL （即倾倒时 液面刚刚闭合时），在超净台面上轻轻晃 动使供试液均匀混合于培养基中，放置一 旁待冷却凝固。2.6.4 培养：待平皿完全冷却凝固，通过 传递窗取出

11、，倒置叠放置于培养箱 中。培养时间及温度：需氧菌菌总 数 30? 35c培养3? 5天霉菌和酵母菌总数20? 25c培养5? 7天，2.7 控制菌检验2.7.1 供试液制备：取供试品10g,用稀 释剂制成1 : 10供试液，匀，在20?25 c培养约2小时（可以在无菌室中先做这一步，等其余试验步骤完成，再继续进 行控制菌的下一步）。耐胆盐革兰阴性菌胰酪大豆月东液体培养基大肠埃希氏菌0. 9%无菌氯化钠溶液沙门菌直接取样品10g或10ml2.7.2 预培养（增菌培养）：取供试液 10mL （相当于1g样品），加在 ml 增菌液体培养基（经方法适用性试验确 定）中，30? 35c培养24? 48小

12、时。耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基大肠埃希氏菌胰酪大豆月东液体培养基沙门菌胰酪大豆月东液体培养基2.7.3 选择和分离培养2.7.3.1 耐胆盐革兰阴性菌：取相当于0.1g、0.01g 和 0.001g（或 0.1ml、0.01ml和0.001tnl）供试品的预培养物或其稀释 液分别接种至适宜体积（经方法适用性试 验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30? 3 5c培养24? 4 8小时。2.7.3.2 大肠埃希氏菌：l ml接种至100 ml 麦康凯液体培养基中，42? 44 c培养24? 4 8小时。2.7.3.3 沙门菌:0.1 ml接种至10mlRV沙 门增菌液体培养基中，30? 3

13、5 c培养18 ? 2 4小时。2.7.4 平板划线分离培养（1）培养基平板的准备：取培养基，融 化并让其冷却至50 c左右，倾入灭菌平 皿中，每个平皿约15mL使其分布均匀， 冷却凝固后即为固体平板培养基。耐胆盐革兰阴性菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基大肠埃希氏菌麦康凯琼脂培养基沙门菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(2)各种物品的准备取出预培养后的控制菌供试液，置于工作 台上；接种前准备好酒精灯、一次性接种 针、火柴、酒精棉球、试管架等。可在阳 性菌室或无菌室操作，无菌室准备工作相 同。(3)平板划线以左手持平板，中指、无名指和小指托着 平板底，拇指和食指打开上盖，使盖与底 成30°角，

14、以便划线。右手握一次性接种针，把接种针上的菌液 涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将 环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划 线引出第2次划线；再从第2次划线引出 第3次划线，如此反复3-4次划线后，即 可把整个平板表面划满，注意每一次划线 只能与上一次划线重叠，这样就可在最后 的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以 便进行纯培养。2.7.4培养：接种后的平板倒置叠放置于 培养箱中，30? 35c培养18? 24小时。2.8培养物的观察2.8.1 需氧菌总数：每天观察菌落的生长 情况，如数目多，应及时点计。2.8.2 霉菌和酵母菌总数：每天观察菌落 的生长情况，如数目多，应及时点计。2.8.3

15、 大肠埃希菌：每天观察菌落的生长 情况。2.8.4 沙门氏菌：菌落为淡红色或无色、 透明或半透明、中心有或无黑色。如有疑 似菌落则用接种针挑选于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接 种，培养18? 2 4小时，或采用其他适宜 方法进一步鉴定。3.数据报告3.1 平皿法：点计平板上生长的所有菌落 数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平 板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释 级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则 报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数 平均值不小于15,则两个平板的菌落数 不能相差1倍或以上。3.2 控制菌3.2.1 耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄 糖琼脂培养基平板上有菌落生

16、长，则对应 培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养 管检查结果，从表2查l g或lm l供试品 中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。3.2.2 大肠埃希菌：若麦康凯琼脂培养基 平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及 适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希 菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落 生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴 性，判供试品未检出大肠埃希菌。3.2.3 沙门菌：若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐 琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三 糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄 色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进 一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙 门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有 菌落生长但鉴定结

17、果为阴性，或三糖铁琼 脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判 供试品未检出沙门菌。3.3 报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和 酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于l00cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最高的平均菌落数，计算lg、lmL或 10cm2供试品中所含的微生物数，取两位 有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌 落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生 长，但平均菌落数小于1时，以< 1乘 以最低稀释倍数的值报告菌数。3.4 结果判断：101cfu:可接受的最大菌 数为20102cfu :可接受的最大菌数为200

18、103cfu :可接受的最大菌 数为2000,依此类推。3.5 限度标准：3.5.1 不含中药原粉的口服中药制剂：需氧菌总数103cfu (<2000)102cfu (0200)霉菌和酵母菌总数102cfu (<200)101 cfu (< 20)大肠埃希菌不得检出沙门菌(含脏器提取物的)不得检出3.5.2含中药原粉的口服中药制剂3.5.2.1 不含发酵原粉需氧菌总数104cfu20000)5 X 102cfu (< 1000)霉菌和酵母菌总数102cfu (<200)102 cfu (< 20)大肠埃希菌不得检出沙门菌(含脏器提取物的)不得检出耐胆盐革兰阴

19、性菌V1023.5.2.2含发酵原粉需氧菌总数105cfu (<200000)103cfu (< 2000)霉菌和酵母菌总数5 x 102cfu(0 1000)102 cfu (W200)大肠埃希菌不得检出沙门菌（含脏器提取物的）不得检出耐胆盐革兰阴性菌V1014.实验时间安排4.1 第一天：准备用具、培养基、稀释剂, 灭菌4.2 第二天：准备无菌室（预计2小时）， 检验（无菌室操作预计3小时），平皿冷 却（夏季预计2小时，冬季预计1小时）， 移出无菌室进行培养（预计 0.5小时） 4.3第三天：观察培养物（需氧菌菌总数、 霉菌和酵母菌总数第一天），耐胆盐革兰 阴性菌、大肠埃希菌、