水质粪大肠菌群一般水样测定作业指导书

1、文件编号：WJES/QZ-0057-2003常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书第1页共5页水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书1 含义及执行标准1.1 含义粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。在培养温度为37 C时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒 44.5 C,仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。一般水样特指除医院污水外的各种水样。本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。 1.2方法原理多管发酵技术是以最可能数

2、（most probable number,简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生 物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。1.3 水环境质量标准表1-1粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002 ）类另II类n类出类IV类V类标准值（个/L）<200<2000<10000< 20000工 40000表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005 ）类另I水作、旱作蔬菜标准值（个/L）工 40000w 20000a, 10000ba 加工、烹调及去皮蔬菜b生食类

3、蔬菜、瓜类及草本水果表1-3粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001 ）类另I污水排放标准值（个/L）工 100002 分析方法2.1 方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 347 2007）方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。2.2 仪器高压蒸汽灭菌器文件编号：WJES/QZ-0057-2003常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书第2页共5页电热干燥箱恒温培养箱冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径 9cm）、刻度吸管等器皿

4、121c （20min）高压 蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白月东培养液中培养对照控制。必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存 活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。2.4 培养基2.4.1 单倍乳糖蛋白月东培养液：市售乳糖蛋白月东培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml,加塞，在115c灭菌20min,贮存于暗处备用。2.4.2 三倍乳糖蛋白月东培养液：市售乳糖蛋白月东培

5、养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸储 水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL,加塞，在115c灭菌20min ,贮存于暗处备用。2.4.3 EC培养液：市售 EC培养基，按铭牌配制，在 115c灭菌20min ,用定量加液器 分装每个试管10ml,加塞，贮存于暗处备用。2.4.4 培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。2.5 分析步骤2.5.1 水样接种量将水样充分混匀后， 根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污

6、染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水样量可参考下表 2。表2接种用水量参考表水样种类接种量（mL）1010.110-210-310-410-5井水XXX河水、塘水XXX湖水、塘水XXX城市原污水XXX2常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号：WJES/QZ-0057-2003名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书第3页共5页如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白月东培养液5mL;如接种量为1mL或少于1mL ,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白陈培养液10mL中。2.5.2 初发酵试验吸取适量水样

7、，按相应的比例将其制成1: 10和1: 100或其他稀释比的稀释样。将水样分别接种到盛有乳糖蛋白月东培养液的发酵管中。在37c±0.5C下培养24h±2ho产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。1:10稀释样品的制作方法为：吸取 1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀， 制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL水样。其它稀释比的稀释样 品同法制作。样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100m

8、L,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。试管内乳糖蛋白月东培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为100mL,倒取100mL样品接种于装有50mL三倍浓度乳糖蛋白月东培养液的大试管内；若接种量为10mL,吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖蛋白月东培养液的试管内；若接种量为1mL时，吸取1mL样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于 1mL时，吸 取1mL稀释样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。2.5.3 复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5C&

9、#177; 0.5C温度下培养24h±2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在 30min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪 大肠菌群阳性。3结果的计算根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2份、10mL10份、总量300mL时，查表3可得每升水样中的粪 大肠菌群；接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，查表4求得MPN指数， MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群。MPN值 MPN指数10（mL）接种量最大的一管（mL)表3、表4见附件4质量控制

10、要求4.1 对照控制采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失 控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性常州市武进区环境监测站作业指导书文件编号：WJES/QZ-0057-2003名称：水质 粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书第4页共5页菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。4.2 精确度同一实验人员所作前 15个阳性水样平行双样结果为Xii、X2i（Xii、X2i>0, i= 1,2,，15）,则精确度判断值=3.27 R o（R （15RJ/R |logXiilogXj）i 1当分析所得R 10gxi

11、 logX2 > 3.27 R表示精密度已失控；否则平行双样 的差距可以接受。5数据处理5.1 数据审核分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。5.2 数据填报粪大肠菌群报告以个/L单位填报，当数量在 100以内按实有数据报告；大于 100采用 二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10的指数形式表示（如报告 16, 000或1.6X104）。6样品采集6.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；6.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于 500mL采样瓶中加入 0.3mL10%硫 代硫酸钠溶液；6.3

12、 样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于 500mL采样瓶中加入 1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液；6.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；6.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；6.6 采样后，样品应2小时内检验，否则，应 10c以下保存且不超过 6小时。7期间核查7.1 人员素质首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。同时站内进行操作技能考 核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，须 要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。7.2 仪器设备臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证 人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。8分析环境条件控制7.3 仪器设备文件编号：WJES/QZ-0057-2003常州市武进区环境监测站作业指导书名称：