MSC体内外促组织修复试验方法

1、MSC勺组织修复作用在机体组织损伤修复过程中,MSC是一种重要的参与组织再生的细胞.在组织损伤引起的特殊信号作用下, MSC迁徙至损伤部位,在局部增殖,并依据不同的损伤信息而沿着 不同的途径分化.MSC易于别离培养,体外增殖水平旺盛,因此,MSC是一种实用的组织修复种子细胞. 目前关于MSC的组织再生功能有两种理论： 其一,将体外扩增的M5c移植到组织损伤部位, 在局部微环境作用下,定向分化为某一特定类型功能细胞,直接参与组织损伤修复过程；其二,移植于损伤部位的细胞,分泌多种生物活性物质,包括细胞趋化、生长、营养因子等, 以改善组织损伤部位再生微循环,促进宿主组织中残存的干/祖细胞增殖分化,M

2、SC间接参与了组织修复过程.MSC改善组织再生微环境,表现为细胞所分泌的生物活性物质具备的多种功能,包括：1趋化周阔的宿主干/祖细胞迁徙至损伤那位；2促进干/祖细胞的增殖分化；3抑 制受损伤功能细胞的凋亡；4促进毛细血管新生；5激活周围细胞金属硫蛋白酶活性, 抑制瘢痕形成；6调节免疫细胞功能,抑制炎性反响.目前,关于MSCfi织再生功能的检测还没有一个明确的标准.在体外检测中,只能通过检测MSO化为受损组织细胞的水平和MSO泌修复组织损伤有关细胞因子、抗炎因子、营养因子等来鉴定MSC勺组织再生功能,这是判定MSCfi织再生功能的根底,但是这样的评判 也存在很大缺陷的, MSC体外的培养环境和在

3、体内微环境中存在很大差异,微环境下细胞 之间的接触作用,损伤细胞释放的因子对 MSC勺刺激作用和趋化彳用等可能都对MSO泌的细胞因子种类和剂量有影响.因此,通过在各种适应症模型治疗时,对MSCE微环境中的组织再生功能的相关指标进行检测是必要的.体外试验：一、检测MSO化为受损组织细胞的水平：体外诱导MSO化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胰岛3细胞、神经细胞、肝细胞、心肌 细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、脊髓基质细胞等.二、检测MSO泌修复组织损伤相关因子：1、促血管生成因子检测： PCR ELISA检测UC-MSCi体外是否分泌 HGF VEGF bFGR TGF- 3 1的因子.2、抗炎性因子

4、检测： PCR ELISA检测UC-MSCi体外是否分泌IL-10 、bFGF TGF-、 IDO.3、促细胞分裂增殖的因子检测：PC址ELISA检测UC-MS窿体外是否分泌 HGF、bFGF、IGF-1、GM-CSF EGF PDGF4、抗细胞凋亡作用：PCR ELISA检测MSB否分泌IGF-1、SDF-1 a、VEGF5、趋化作用：PCR ELISA 检测 MSC否分泌 SDF-1 CXCR4、IL-6、IL-8、CXC MCP-1.体内试验：MSC台疗肝硬化模型、MSC台疗肾损彳模型、MSC啰复坏死胰腺组织、MSC用于心血管疾病的 治疗、MSCffi于肺纤维化模型等MSC治疗肝硬化模型

5、在CCl4诱导的肝硬化模型中,MSC通过抑制肝脏胶原合成、 诱导肝脏内源干细胞的分化增殖、抑制CCl4引起的肝损伤和炎症、促进肝脏血管再生等作用来改善肝脏病变状况.检测指标包括：1、MSC抑制胶原合成作用：肝病变部位 胶原的含量2、促细胞生长作用：HGFT、bFGF 成纤维细胞生长因子T、 PDGF 血小板衍生因子3、纤维化逆转作用：组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1 J、TGF3 J的表达4、炎性和抗炎性因子检测：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、 IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK

6、细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生 H2O2.5、促血管生成作用：HGF肝细胞生长因子T、VEGF血管内皮生长因子T、 TGF-1 转化生长因子T、 bFGF 成纤维细胞生长因子T、 PDGF 血小板衍生 因子T、内皮素endothelin T、表皮调节蛋白 epiregulin T等.6、检测输注阳性标记 MS%受损组织中是否存在.7、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势.8、观察统计治疗组与对照组动物的精神状态或存活状态.9、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常.10、检测受损组织的功能是否有所改善.11、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况,检测炎

7、性因子分泌情况.12、受损组织中趋化因子 SDF-1T、IL-8T、CXC T、MCP-1 T 单核趋化蛋白 等的含量.MSC治疗肾损伤模型在急性肾损伤、慢性肾损伤等动物模型中,MSC通过诱导肾脏内源干细胞的分化增殖、肾小管上皮细胞增殖、抑制肾脏损伤和炎症、促进肾脏血管再生等作用改善肾脏功能.检测指标包括：1、促细胞生长作用：HGFT、bFGF 成纤维细胞生长因子T、PDGF 血小板衍生因子T2、炎性和抗炎性因子检测：IL-6,、TNF- a,、INF- 丫,、IL-1 、一氧化氮合酶 ,、IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用还表现在抑制 T细胞

8、、NK 细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2.3、促血管生成作用：HGF肝细胞生长因子T、VEGR血管内皮生长因子T、TGF-1 转化生长因子T、bFGF 成纤维细胞生长因子"PDGF 血小板衍生因子T、内皮素endothelin T、表皮调节蛋白epiregulin T等.4、检测输注阳性标记 MSCB受损组织中是否存在.5、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势.6、观察统计治疗组与对照组动物的精神状态或存活状态.7、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常.8、检测受损组织的功能是否有所改善.9、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况,检测

9、炎性因子分泌情况.10、受损组织中趋化因子 IL-8、CXC、MCP-1 单核趋化蛋白的含量.MSC修复坏死胰腺组织造模：处理胰腺组织,造胰腺组织坏死模型：开腹结扎胰腺组织,7-8小时后,胰尾局部组织变黑坏死,周围有炎性细胞浸润.治疗：在胰腺未损伤部位植入胰腺DAPI标记的胰腺MSC细胞.检测指标：1、观察胰腺组织外观是否趋于正常,切片胰岛细胞是否趋于正常；2、DAPI标记的阳性 MSC在胰腺组织是否存在,数量多少；3、治疗组和未治疗组的动物精神状态和成活率比照；4、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋势.5、组织切片观察治疗组受损组织结构、功能细胞分布是否趋于正常.6、检测受损

10、组织的功能是否有所改善.7、病理切片观察受损组织周围炎性细胞情况,检测炎性因子分泌情况.8、受损组织中趋化因子 SDF1T、IL-8T、CXCT、MCP-1 T 单核趋化蛋白的含量.9、促细胞生长作用：HGF、bFGF 成纤维细胞生长因子3 PDGF 血小板衍生因子T10、炎性和抗炎性因子检测：IL-6J、TNF-a J、INF-丫 J、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生 H2O2.11、促血管生成作用：HGF肝细胞生长因子T、VEGF血管内皮生长

11、因子T、 TGF-1 转化生长因子T、 bFGF 成纤维细胞生长因子T、 PDGF 血小板衍生因 子T、内皮素endothelin T、表皮调节蛋白 epiregulin T等.MSC用于心血管疾病的治疗在心肌堵塞、心肌缺血性损伤等模型中,MSC的治疗作用表现为保护心肌细胞、促进心脏祖细胞的分化增殖、抑制心脏炎症反响、促进心脏血管生成,促进神经细胞再生、改善 心脏功能.检测指标包括：1、观察心脏组织外观是否趋于正常,切片心肌细胞是否趋于正常；2、移植阳性MSC在心脏受损部位是否存在,数量多少；3、治疗组和未治疗组的动物精神状态和成活率比照；4、观察受损组织的外观、质地与对照组相比是否有恢复的趋

12、势.5、组织切片观察治疗组受损心脏组织结构、功能细胞分布是否趋于正常.6、检测受损心脏组织的功能是否有所改善.检测神经前体细胞NPC的增殖胶质纤维酸性蛋白GFAP的表达.7、病理切片观察受损心脏组织周围炎性细胞情况,检测炎性因子分泌情况.8、受损组织中趋化因子 IL-8、CXC、MCP -1 单核趋化蛋白的含量.9、促细胞生长作用：HGF、bFGF 成纤维细胞生长因子3 PDGF 血小板衍生因子T、IGF-110、炎性和抗炎性因子检测： IL-6J、TNF-a J、INF-丫 J、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、 IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC移植

13、可以减少心肌层 CD68+T细胞的增 加和减少单核细胞趋化蛋白MCP-1的表达.11、促血管生成检测：HGF肝细胞生长因子T、VEGF血管内皮生长因子T、 TGF-1 转化生长因子T、 bFGF 成纤维细胞生长因子3 PDGF 血小板衍 生因子T、内皮素endothelin T、表皮调节蛋白 epiregulin T等.12、造血因子分泌检测：IL-8、GM-CSR M-CSF、TNF- “等.13、神经营养因子分泌检测：IGF-1、BDNF、GDNR NGF、TIMP-1等.MSC用于肺纤维化模型在博来霉素诱导的肺纤维化模型中,MSC移植可以抑制肺纤维化,同时MSC产生IL-1受体拮抗剂一种

14、抗炎性的可溶性因子,减轻博来霉素导致的肺损伤.虽然有一些实验证据,但是目前MSC抑制肺脏纤维化还有争议.检测指标：1、MSC抑制胶原合成作用：肺病变部位胶原的含量2、促细胞生长作用：HGF、bFGF 成纤维细胞生长因子T、 PDGF 血小板衍生因子3、纤维化逆转作用：组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1 J、TGF3 J的表达4、炎性和抗炎性因子检测：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、IL-10 T、bFGFT、 TGF-aT、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用还表现在抑制T细胞、NK细胞、B细胞的增殖和抑制中性粒细胞产生H2O2.5、促血管生成作用：HGF肝细胞生长因子T、VEGF血管内皮生长因子T、 TGF-1 转化生长因子T、 bFGF 成纤维细胞生长因子T、 PDGF 血小板衍生因 子T、内皮素endotheli