杜仲饮片HPCE指纹图谱的研究(中药材)

1、杜仲饮片HPCE指纹图谱的研究摘要 目的： 建立杜仲饮片HPCE-DAD指纹图谱分析方法，并对杜仲及其炮制品的指纹谱进行比较。方法：采用高效毛细管电泳法进行色谱分离，以60mmol·L 1硼砂-20 mmol·L 1 磷酸二氢钠-10%甲醇(pH= 10.0)为运行缓冲液，分离电压为20 kV，波长为210nm，以松脂醇二葡萄糖苷为参照物（IS），测定其指纹图谱，并作模糊聚类法分析和相似度评价。结果： 初步建立了以10个共有峰为特征指纹信息的杜仲饮片HPCE-DAD指纹图谱；发现少数杜仲饮片的指纹图谱有一定差异，生品与其炮制品的指纹谱中共有峰相对峰面积差异显著。结论： 方法

2、准确可靠，重现性好，可作为杜仲饮片内在质量评价的依据。关键词 杜仲；高效毛细管电泳二极管阵列检测法；指纹图谱Studies on HPCE-DAD fingerprint of Eucommiae CortexFU Xing-sheng, HAN Le , LIU Xun-hong*, XU Hu , LI Jun-song , CAI Bao-chang，YANG Yan(Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210046, China)Abstract Objective: To establish the analytical

3、method for the fingerprint of Eucommiae Cortex by HPCE-DAD and compare the fingerprints of Eucommiae Cortex and its processed products. Method: Based on the mode of high performance capillary electrophoresis，60mmol·L-1 sodium borate-20 mmol·L1 sodium dihydrogen phosphate-10% methanol (pH10

4、.0) was used as buffer solution. The separation voltage was 20 kV and the detection wavelength was set at 210 nm. Pinoresinol diglucoside was used as a reference standard，the chromatographic fingerprint were determined. The data were analyzed by fuzzy cluster and fingerprint similarity evaluation so

5、ftware to compare the similarity of samples. Result: HPCE-DAD fingerprints with 10 common peaks of Eucommiae Cortex were established preliminarily. It was discovered that a small number of samples differed from others. Regarding to the fingerprints of Eucommiae Cortex and its processed products，ther

6、e were obvious differences in the relative areas of common peaks. Conclusion: The method is reliable， accurate and can be used for quality control of Eucommiae Cortex.Key words Eucommiae Cortex；HPCE-DAD；Fingerprint杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，具有补肝肾，强筋骨，安胎等功效，用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血、胎动不安

7、等症1。现代研究表明，松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸和环烯醚萜苷类为主要活性成分。目前，多采用高效液相色谱法，以松脂醇二葡萄糖苷或绿原酸等含量为质控指标，分析和评价杜仲药材或饮片的质量2-6，这种对一种或几种成分的检测不足以全面反映药材的质量，也缺乏专属性。中药色谱指纹图谱用于中药质量控制，比目前沿用的方法提供的信息要丰富，高效液相色谱法已应用于杜仲的指纹图谱研究7,8。本文采用高效毛细管电泳法对杜仲饮片指纹图谱的构建进行了探讨，并与其炮制品进行比较分析，以期为规范杜仲饮片市场及确保药材内在质量的均一性和稳定性提供较全面的质量控制手段。1 仪器与材料G1600-AX高效毛细管电泳仪（美国Agilen

8、t公司），配惠普化学工作站、二极管阵列检测器（DAD）、自动进样器；Rotavapor R-3旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；pHS-3C型pH计（上海康仪仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。硼砂（南京化学试剂一厂，分析纯），氢氧化钠（上海化学试剂有限公司，分析纯），磷酸二氢钠（汕头金砂化工厂，分析纯），甲醇（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯），无水乙醇（南京化学试剂有限公司，分析纯），乙酸（南京化学试剂有限公司，分析纯），配制缓冲溶液和供试品溶液所用的水均为重蒸馏水。对照品：松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，批号：1153

9、7-200501）、桃叶珊瑚苷（aucubin，批号：111761-200601）、京尼平苷（geniposide，批号：110749-200714）、绿原酸（chlorogenic acid，批号：110753-200413）、哈巴苷（harpagide，批号：111729-200602）均购于中国药品生物制品检定所。样品：杜仲不同产地（批次）样品编号见表1。S1S10为杜仲药材商品，均经南京中医药大学中药鉴定教研室刘训红教授鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮。S11、S12为S3相对应的炮制品，按2010年版中国药典规定自制。留样凭证存放于南京中医

10、药大学江苏省中药炮制重点实验室。表1 杜仲样品编号样品产地样品提供单位批号S1杜仲湖北南京市中医院080811S2杜仲贵州南中医药大百草堂100615S3杜仲四川江苏省中医院20100726S4杜仲四川南京轩德堂中医门诊部100802S5杜仲四川安徽国鑫中药饮片有限公司100612S6杜仲四川安徽省亳州市药材总公司100925S7杜仲江西安徽省亳州市永刚饮片厂20070801S8杜仲四川南京药业股份有限公司中药饮片厂101218S9杜仲四川南中医药大国医堂101115S10杜仲江西南京市交通医院110201S11炒杜仲四川江苏省中医院20100726S12盐杜仲四川江苏省中医院20100726

11、2 方法与结果2.1 电泳条件 未涂渍标准熔融石英毛细管（64.5 cm´ 75 µm，有效长度56 cm，Agilent科技有限公司）；运行缓冲液：60mmol·L1硼砂-20 mmol·L1 磷酸二氢钠-10%甲醇(pH= 10.0)；检测波长：210 nm；分离电压：20 kV；压力进样：5 kPa×6 s；毛细管温度：25 。毛细管使用前依次用0.1 mmol·L1氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液压力冲洗5、10、5 min，样品分析间隔用0.1 mmol·L1氢氧化钠溶液、水、缓冲液平衡3、5、5 min。上述试

12、剂使用前均经0.22m滤膜过滤，并超声脱气。2.2 对照品溶液制备 取桃叶珊瑚苷20.00mg、京尼平苷5.13mg、松脂醇二葡萄糖苷10.20mg、哈巴苷19.90mg，精密称定，分别置于10 mL量瓶中；取绿原酸10.20mg，精密称定，置于5mL量瓶中，上述对照品用50%甲醇溶解并定容。制得浓度分别为桃叶珊瑚苷2.000mg·mL-1、京尼平苷0.513mg·mL-1、松脂醇二葡萄糖苷1.020mg·mL-1、哈巴苷1.990 mg·mL-1、绿原酸2.040 mg·mL-1对照品储备液。精密吸取桃叶珊瑚苷1mL、京尼平苷2mL、松脂醇二

13、葡萄糖苷5mL、哈巴苷1mL、绿原酸1mL置10 mL量瓶中，用50甲醇定容，即得桃叶珊瑚苷0.2000 mg·mL-1、京尼平苷为0.1026 mg·mL-1、松脂醇二葡萄糖苷为0.5100 mg·mL-1、哈巴苷0.1990 mg·mL-1、绿原酸为0.2040 mg·mL-1的混合对照品溶液。2.3 供试品溶液制备 取杜仲药材适量，剪成碎片，揉成絮状，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，超声提取30 min，过滤，用50%甲醇定容于25mL量瓶中，摇匀，过0.22 µm微孔滤膜，作为供试品溶液。2.4

14、 方法学考察2.4.1 精密度试验：取同一批次供试品（S3）溶液，连续进样5次，测定杜仲指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.995，表明供试品进样精密度良好。2.4.2 稳定性试验：取同一批次供试品（S3）溶液，分别在1、2、4、8、16、24h进样6次，测定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.992，说明供试品溶液在24h内稳定。2.4.3 重复性试验：取同一批次样品（S3）粉末6份，平行操作，制备供试品溶液，测定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相似度均大

15、于0.827，表明本法测定的重现性尚好。以上结果表明指纹图谱中各色谱峰的相对迁移时间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研究的的技术要求。2.5 指纹图谱的建立： 将供试品溶液分别放入自动进样的样品管中，按选定的测试条件进行检测。同一上述实验条件下，测定所有供试品HPCE色谱图。根据不同批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对迁移时间）等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。（图1，图2）图1 杜仲的HPCE-DAD指纹图谱1. 桃叶珊瑚苷 2.京尼平苷 3.松脂醇二葡萄糖苷 5.哈巴苷 10.绿原酸图2 杜仲的三维HPCE-DAD指纹图谱2.6 指纹图谱分析2

16、.6.1 共有指纹峰标定： 经对供试品HPCE色谱图的分析、比较，杜仲标定10个共有峰作为指纹图谱的特征峰，1、2、3、5、10号峰与对照品对照分别鉴定为桃叶珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷、绿原酸。以3号峰松脂醇二葡萄糖苷为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的值（调整迁移时间之比）和各共有峰的相对峰面积（峰面积之比）。（表2）表2 杜仲HPCE-DAD指纹图谱中共有峰的相对迁移时间值和相对峰面积峰号12345678910相对迁移时间0.88880.94861.00001.30581.53781.60641.68231.75781.80942.0777相对峰面积S10.04210.01

17、601.00000.28340.01450.01140.02280.43260.40730.0294S20.03690.01121.00000.27430.01100.00970.01740.43150.39210.0272S30.04660.01561.00000.31210.01580.01310.02650.46250.43760.0322S40.04720.02001.00000.33470.01530.01650.02790.53360.44280.0358S50.04900.02201.00000.36540.01990.02010.03110.57770.51290.0397S6

18、0.04670.02111.00000.29080.01660.01230.02440.45510.49550.0373S70.03970.01001.00000.26200.00920.00870.01550.41630.41210.0263S80.04710.01751.00000.31010.01100.01420.03070.49310.43140.0341S90.04760.01901.00000.29880.01240.01070.03310.45310.42660.0342S100.04010.01891.00000.26740.01040.01180.01860.41770.4

19、1870.03302.6.2 指纹图谱的聚类分析：选择杜仲HPCE指纹图谱中10个比较明显的共有峰，根据表2中的数据，用SPSS软件中的hierarchical cluster analysis对10个杜仲样品进行聚类分析，所用聚类方法为average linkage (between groups)，距离公式为square euclidean distance，得不同样品杜仲的聚类分析图。（图3，图4）图3 杜仲HPCE-DAD指纹图谱的聚类分析图结果显示，当距离标尺在1时，样品S1、S2、S7、S10，样品S3、S9各归为一类；在2时，样品S3、S9与S8归为一类；在6时，样品S1、S2、

20、S7、S10、S3、S9、S8归为一类；在9时，样品S1、S2、S7、S10、S3、S9、S8、S6，样品S4、S5各归为一类；当距离标尺在25时，所有样品才归为一类。图4 杜仲HPCE-DAD指纹图谱中共有峰组分含量图2.6.3 色谱峰的重叠率：以杜仲对照谱图（R）为基准，按以下公式计算待测样品与对照谱图共有的峰数×2/(待测样品与对照谱图峰数和)×100，110号样品色谱峰的重叠率依次为：86.50%，87.45%，89.35%，89.75%，89.45%，89.75%，89.50%，89.25%，89.35%，88.50%。2.6.4 相似度评价：将测试数据导入国家药

21、典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件，经校正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，生成对照图谱（图5），进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下：S1-0.947，S2-0.951，S3-0.970，S4-0.975，S5-0.982，S6-0.981，S7-0.973，S8-0.974，S9-0.972，S10-0.956。结果表明，杜仲样品指纹谱相似度较好（>0.94）。图5 杜仲样品HPCE指纹图谱共有模式2.6.5 生品与其炮制品的指纹谱比较： 经对杜仲生品（S3）与其炮制品（S11，S12）的指纹图谱比较、分析，炒杜仲、盐杜仲均具有杜仲生品的10

22、个共有峰，但色谱峰的重叠率、n强峰峰面积比值及色谱图相似度具有一定差异。以杜仲生品谱图为基准，计算炮制品色谱峰的重叠率，炒杜仲为78.6%，盐杜仲为79.4%；以桃叶珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷及绿原酸为n强峰，其峰面积比值：生杜仲为0.047: 0.016 : 1 : 0.016: 0.032，炒杜仲为0.041: 0.020 : 1 : 0.010: 0.030，盐杜仲为0.039: 0.024 : 1 : 0.007: 0.027；以杜仲生品谱图为基准，计算炮制品色谱图的相似度，炒杜仲0.885，盐杜仲0.871。(图6) 图6 杜仲炮制品HPLC图谱A.炒杜仲 B.盐杜仲

23、1.桃叶珊瑚苷 2.京尼平苷 3.松脂醇二葡萄糖苷 4.哈巴苷 5.绿原酸3 讨论3.1 电泳条件的优化：缓冲液体系、缓冲液浓度及pH值的选择： 实验考察了硼砂、硼砂-磷酸二氢钠和硼砂-磷酸二氢钠-甲醇3个体系的缓冲溶液，经反复实验确定以硼砂-磷酸二氢钠-甲醇体系为缓冲体系，色谱峰峰形、分离度较好。在此基础上，对缓冲液浓度及pH值进行了考察，结果表明，当缓冲液浓度为60mmol·L 1硼砂-20 mmol·L 1 磷酸二氢钠-10%甲醇时各色谱峰的分离度较好；当pH为10.0时各组分可以达到基线分离。分离电压和运行温度的选择：考察了分离电压在1625 kV范围内对各组分迁移

24、时间的影响，结果表明，当分离电压为20 kV时样品及对照品各待测组分仍然可以达到基线分离且节省时间；考察了运行温度在2025 范围内对各组分迁移时间的影响，结果表明，当运行温度为25 时样品的各组分分离效果好，且分析时间缩短。检测波长的选择：采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱图。结果在210nm检测波长下，色谱图中色谱峰较多，信息丰富。3.2 指纹谱分析：指纹谱分析结果表明，不同批次杜仲样品之间既有相关性，又有区别。相应共有指纹峰均已在色谱图上体现，色谱峰重叠率、指纹谱相似度较好，但各峰面积有所不同，说明不同来源、不同产地(批次)杜仲饮片其成分含量有一定差异。通过与对照品对照分析，桃叶珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷及绿原酸可列为杜仲指纹谱共有特征峰中n强峰，其配比关系为（0.0370.049）:（0.0100.022）: 1 :（0.0090.020）:（0.0260.040），这对评价杜仲药材质量具有一定意义。杜仲生品与其炮制品的色谱图比较