甘油菌活化和质粒提取

1、一、甘油菌活化1.LB培养基制备：胰蛋白豚10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800mL搅拌,使溶质完全溶解,用5mol/LNaOH约0.2ml调节PH至7.4,参加去离子水至1000ml,高压蒸汽灭菌20min.灭菌后注意密封,4c能存放1个月.含琼脂的LB培养基：上述液体培养基高压灭菌前参加15g/L铺制平板用或7g/L配制顶层琼脂糖用琼脂糖,高压灭菌20min.2.倒平板2.1超净台,接种环,灭菌培养皿,酒精灯等紫外灭菌30min.2.2培养基局压后放在60c水浴锅中保温.溶液尚未冷却时,即应取出培养基,并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中.小心培养基过

2、热,旋动液体产生暴沸.2.3冷却至50C,在超净台中参加抗生素等不耐热的物质现用现加,为预防产生气泡,混匀培养基时应采用旋动的方式,然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板.2.4从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上,不要等到融化 反复冻溶不利于长期保存,直接用枪头接种环在冻存管内的冰磴上蘸一下,然后马上涂平板即可.37c培养12-16h.第二天挑单克隆大量培养.3.大量培养3.1冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌,待冷却至50c左右参加抗生素.3.2在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中2-5mL,37C,200rpm培养8ho3.3按1:500至1:1000的比例,用加抗生素的液态LB培

3、养基稀释3.2所得菌液.25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基.37C,200rpm培养12-16小时.使密度到达3-410A9/mL.OD600在0.5左右.在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值,OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期,活力最正确.二、质粒提取1,准备工作1.1 RNaseA用前瞬离.一小瓶RNaseA力口至U1瓶bufferP1中,使终浓度为100ug/mLoOptional:按1:1000的比例,在bufferP1中力口入LyseBlue.1.2检查bufferP2是否有沉淀SDS,低温环境,如果有沉淀,将P2放置37c条件下,以使沉淀溶解.

4、1.34c预冷bufferP3o2,质粒提取2.1上述菌液,6000g,4c离心15min,收集沉淀.假设不马上进行实验,沉淀可-20C保存2.2用QIAGEN质粒提取试剂盒中的4mLbufferP1重悬.为使裂解充分,容器要足够大,使充分混匀保证bufferP1中已参加RNaseA如 果bufferP1中 加 了LyseBlue,重 悬 菌 液 之 前 , 应 将 混 合 液bufferP1+LyseBlue用力混匀涡旋或上下颠倒混匀,使重悬菌液无团块2.3参加4mLbufferP2,颠倒混匀4-6次,室温15-25C静置反响5min.千万不可用振荡器混匀,会使DNA链断裂静置时间不要超过5

5、minBufferP2用后立即密封,以防空气中的CO2使其酸化此时裂解菌液应是粘稠的如果bufferP1中参加了LyseBlue,那么参加bufferP2并混匀后,应出现均匀的蓝色,如果出现局部无色或棕色团块,应继续颠倒混匀2.4力口入4mL预冷bufferP3,立即用力颠倒混匀4-6次,冰上静置15min.注意低温操作预冷,冰上静置,目的是促沉淀参加bufferP3后,出现白色蓬松状沉淀,沉淀为基因组DNA,蛋白质,细胞碎片,KDS.此时,裂解液粘稠度应降低如果bufferP1中参加了LyseBlue,沉淀过滤后,溶液应该是无色的,表明SDS已经充分沉淀2.5离心前混匀,20000g,4c离

6、心30min.快速吸取上清含质粒.2.6上清封20000g,4c离心15min.吸取上清.Optional:取240uL上清,做凝胶电泳分析,以判断培养和别离是否合理2.7平衡QIAGENtip-100,向QIAGENtip-100中参加4mLbufferQBT,重力作用自然流下.2.8将2.6中的上清参加2.7平衡过的QIAGENtip-100中.提前平衡QIAGENtip-100,使得上清尽快参加,如果间隔时间太久, 蛋白沉淀变混浊应再次离心以免堵塞QIAGENtip-100Optional:取240uL流出的液体,做凝胶电泳分析,质粒DNA与QIAGEN树脂的结合效率2.9用bufferQC洗QIAGENtip-100,一次10mL,洗2次.第一遍去除质粒提取试剂中的大局部杂质,如果菌液体积大或菌体产生大量碳水化合物时第二遍清洗那么必要的Optional：2.10用5mLbufferQF洗脱DNA,用15mL管收集洗脱液.不可用聚碳酸酯离心管不耐乙醇如果重组质粒大于45-50kb,65c预热bufferQF可洗脱效率Optional:洗脱下来的DNA可4c暂存,但不建议过夜2.11加3.5mL0.7倍洗脱液体积室温异丙醇沉淀质粒DNA,混匀,15000g,4c离心30min,或者5000g,4c离心60min.小心弃去液体.室温异丙醇：减少盐沉淀4c离心：预防样