细胞活性和增殖的检测

1、细胞活性和增殖的检测 在培养细胞的消化分别、传代、冻存和复苏等过程中，均可导致细胞死亡。在培养中可通过常规观看了解培养细胞的生长情况，也可通过一些实验检查细胞的活性。 （一）培养细胞的常规观看 普通在细胞接种或传代后，天天或至多间隔12天，应观看细胞的形态、生长、培养液ph和污染与否等，随时把握细胞的动态变幻，以便做换液或传代处理。如发觉异样状况，准时实行措施。 细胞生长过程中，co2堆积增多，因为培养基内含有ph指示剂，因此其色彩的变幻可间接反映细胞的生长状态。正常状况下培养液呈桃红色；呈橙黄色时，细胞普通生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时光过长，养分不足，细胞死亡过多；呈紫红色则可能是细

2、胞生长状态不好，或已死亡。若发觉有的培养瓶内浮现培养液浑浊，要准时挑出来结束培养，否则可能将培养细胞的污染向周围蔓延。 （二）培养细胞的活力检测 细胞活力对推断细胞培养的胜利与否具有重要作用。检查细胞活性通常用法染色拒斥法、mtt比色法、中性红实验和荧光素双乙酸盐实验等（表2-1)。 1锥虫蓝（trypan blue，音译为台盼蓝，即商品名）拒染法 【材料】 (1)待测活力的细胞（贴壁细胞或悬浮细胞）； (2）培养及消化用液：待测细胞的培养液、hanks液，0.25%和0.02% edta混合消化液； (3) 0.4锥虫蓝（用pbs配制），载玻片和盖玻片等。 【办法】 (1)待测细胞是贴壁细胞

3、，倒掉培养液，加入消化液，在37条件下消化12分钟。然后吸出消化液，加入一定量的培养液，吹打并制成细胞悬液；假如是悬浮培养细胞，可挺直用于检测细胞活力。 (2）取0. 2m1待测细胞悬液，加入0.5 ml 0.4锥虫蓝溶液和0.3 ml hanks液，充分混匀，立刻取上述细胞悬液少许滴于载玻片上，覆以盖玻片，用低倍镜起码计数200个细胞和其中蓝染的细胞。按下列公式计算细胞存活率。 细胞存活率（）=（总细胞数-蓝染细胞数）总细胞数×100% 【结果】 正常细胞不着色，死细胞因细胞膜通透性增大，锥虫蓝进入细胞内使其染成蓝色。细胞存活率在90以上比较好，细胞分装后举行培养的胜利率大，存活率

4、在70以下的细胞，培养胜利的机会不大。 【注重事项】 (1)测试细胞活力的锥虫蓝染液对细胞膜有一定的影响，假如含有锥虫蓝的细胞悬液放置时光过长，正常细胞也可摄取染料，影响细胞活力测试结果的精确性，故在细胞悬液中加入锥虫蓝后，要赶紧时光举行细胞计数，囫囵过程不应超过10分钟。 (2）锥虫蓝法虽然简便迅速，但对检测细胞活力却是一种较粗略的办法，它不能精确地反映细胞代谢活性的差异。 2. mtt比色法 四氮唑盐3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tertrazolium bro-mide, mtt比色法能较精确地反映细胞的存活状态，较为常用。mtt在不

5、含的培养液中溶解后呈黄色，活细胞线粒体在三羧酸循环中，琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢，mtt可接受脱下来的氢离子，使可溶性的黄色mtt溶液还原为紫蓝色、不行溶性的甲臜(formazan）颗粒，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。再用(dmso )或酸性异可溶解紫蓝色的甲臜颗粒，在酶标仪下测定其光汲取值，即可计算出存活细胞数。该法除用于细胞活力检测外，还被用于细胞毒性试验和抗肿瘤药物的筛选等。 【材料】 (1)待测细胞：培养的贴壁细胞或悬浮细胞； (2) mtt溶液：用不含酚磺酞的培养液或用0.0l mol/l pbs (ph 7.27.4）配成5mg/ml的mtt，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，再

6、用0.22um微孔滤器过滤除菌。该液要现用现配或配好后避光4储存备用一周。 （3）溶解剂：酸性异溶液是用0.040.lmol/l盐酸配制。 (4）其他用具：振荡混合仪、无菌的96孔板、加样枪及枪头、酶标仪等。 【办法】 (1)在培养皿中按培养液量的10加入mtt溶液，于37下继续培养4小时。 (2）吸去培养液，加入与培养液等量的dmso或酸性异；对于悬浮生长的细胞需离心（1000r/min,5分钟），当心吸弃培养液，再加入与培养液等量的dmso或酸性异丙醇。在振荡混合仪上振荡10分钟，使结晶充分溶解，即使紫蓝色沉淀充分溶解。 (3）用酶标仪在波长490nm下检测，参考波长450600nm。以只

7、加培养液的培养皿为空白对比组，计算细胞存活率。公式如下： 细胞存活率（）=实验组光汲取值对比组光汲取值×100% 【结果】 活细胞在三羧酸循环中能催化琥珀酸脱氢，mtt（黄色可溶性液体）接受氢离子还原为甲臜( formazan )颗粒（液体中含有紫蓝色不行溶性颗粒），dmso或酸性异丙醇可溶解紫蓝色的甲臜颗粒，使mtt从黄色变为紫蓝色；而死细胞则无此功能，mtt仍保持原先的黄色。在酶标仪下测定mtt和细胞培养液反应后的色彩变幻，即可指示培养液中细胞的存活率。 【注重事项】 (1)高浓度血清会影响光汲取值，培养液中常用法10% fbs，在加入dmso或酸性异丙醇之前应尽量吸净培养液。 (2）吸去培养液时，动作要慢，以免吸去甲臜颗粒。