电化学免疫传感器的构建及用于突触核蛋白的检测

1、基于树枝状高分子化合物及功能化纳米金粒子的电化学免疫传感器的构建及用于a-突触核蛋白的检测An Electrochemical Immunosensor Based on Dual Signal Amplification Strategy of PAMAM-Au Dendrimer and functionalized Gold Nanaoparticle for a-Synuclein determination作 者: *学 号: *专 业： 化学系（应化）班 级: 07级指导老师: *职 称： 教授2011年5月18日目录摘要2Abstract21引言22实验部分42.1化学试剂42.

2、2实验仪器42.3 G4-PAMAM-Au纳米簇合物的合成42.4纳米金功能探针HRP-Ab2-Au的制备42.5PAMAM-Au修饰免疫传感器的制备52.6 -突触核蛋白的固定及免疫分析52.7 安培检测法63结果和讨论63.1 o-ABA的电聚合63.2PAMAM-Au纳米复合物的表征73.3 AuNPs和纳米金功能探针HRP-Ab2-Au的TEM表征83.4免疫传感器的AFM表征93.5免疫传感器表面的电化学性质93.6实验条件的优化103.7免疫传感器的电流响应113.8传感器的重现性、稳定性和再生性124结论12参考文献13致谢14基于树枝状高分子化合物及功能化纳米金粒子的电化学免疫

3、传感器的构建及用于a-突触核蛋白的检测摘要：-突触核蛋白（a-SYN）是一种与帕金森疾病密切相关的病理学蛋白。本文利用G4 PAMAM-Au纳米簇合物和酶标抗体技术，通过双信号放大方法制备了一种新型的电化学免疫传感器，并成功用于-突触核蛋白的检测。其中，PAMAM-Au纳米簇合物用于构建该传感器的载体，其表面丰富的氨基能够结合大量的抗原，由此扩大检测信号。另外，将HRP标记的二抗分子（HRP-Ab2）固定于金纳米粒子（AuNPs）表面，通过间接免疫反应将此纳米金功能探针与一抗结合。AuNPs较大的表面积增加了HRP的负载量，进一步扩大了检测信号。在优化的实验条件下，该免疫传感器响应的峰电流值与

4、-突触核蛋白浓度在20 pg/mL 200 ng/mL的范围内保持良好的线性关系，检出限为14.6 pg/mL，并且该传感器具有良好的稳定性、重现性和灵敏度。关键词：PAMAM-Au纳米簇合物 纳米金功能探针 -突触核蛋白 免疫传感器An Electrochemical Immunosensor Based on Dual Signal Amplification Strategy of PAMAM-Au Dendrimer and functionalized Gold Nanaoparticle for a-Synuclein determinationAbstract: a-synucl

5、ein is a very important neuronal protein which is associated with Parkinson Disease. In this paper, we utilized Au-doped TiO2 nanotubes to design a novel photoelectrochemical immunosensor for sensitive detection of a-synuclein. The highly ordered TiO2 nanotube arrays were fabricated by electrochemic

6、al anodization technique on a pure Ti foil. After that, a photoelectrochemical deposition method was exploited to modify the resulting nanotubes with Au nanoparticles, which have been demonstrated to facilitate the improvement of the photoecurrent responses. Moreover, the Au-doped TiO2 nanotubes con

7、structed an effective antibody immobilization array and made the primary antibodies (Ab1) immobilized with high stability and bioactivity to bind the target a-synuclein (a-SYN). The enhanced sensitivity was obtained by using Ab2-Au-GOx bioconjugates, which was featured with secondary antibody (Ab2)

8、and glucose oxidase (GOx) labels linked to Au nanoparticles for signal amplification. The GOx enzyme immobilized on the prepared immunosensor can catalyze glucose in detection solution to produce H2O2, which acts as a sacrificial electron donor to scavenge the photogenerated holes generated in the v

9、alence band of TiO2 nanotubes upon irradiation of the other side of Ti foil and leads to a remarkable photocurrent. The increased photocurrents, highly reproducible for on/off cycles of illumination, were proportional to the a-synuclein concentrations, and the linear range of the developed immunosen

10、sor for a-synuclein detection was from 0.5 to100 ng/mL with a detection limit of 0.13ng/mL.This proposed method showed high sensitivity, stability, reproducibility, and could become a promising technique for protein detection.Keywords: PAMAM-Au nanohybrid Bioconjugates a-synuclein Immunosensor 1引言根据

11、抗体与抗原之间的专一性反应而建立的免疫分析1，已经广泛应用于生物样品中蛋白质的定量检测。近年来，许多免疫分析技术得到迅速发展，如电化学免疫传感器、化学发光免疫传感器、荧光免疫传感器、压电免疫传感器和表面等离子共振免疫传感器。由于电化学免疫传感器具有灵敏度高、检测限低等优点，该传感器的研究得到了人们的广泛关注。不同的电化学免疫传感器，尤其是电流型免疫传感器，已经逐渐发展并应用于重要生物分子的检测2-5。帕金森病（PD）是一种常见于中老年患者的神经退行性疾病，其发病机制主要是黑质中多巴胺神经元细胞的选择性死亡6。近来有研究表明，-突触核蛋白是一种与神经退行性疾病密切相关的病理学蛋白7-8，体内过多

12、的-突触核蛋白会影响PD的遗传形式9-10。因此-突触核蛋白的检测对阐明其在神经系统疾病病理学研究和临床诊断上具有非常重要的意义11。目前，已经有许多方法用于-突触核蛋白的定量检测12-13，比如核磁共振技术14、荧光技术15、蛋白质印迹法12和尺寸排阻色谱法16等。然而，这些方法存在仪器复杂、费用昂贵和检测时间长等缺点17。因此，发展灵敏、快速的传感技术受到了广泛的关注。随着免疫技术的发展，如何增加抗原固载量和放大信号成为提高免疫传感器灵敏度的两个关键因素。在众多纳米材料中，AuNPs的稳定性高、传导性好，尤其以聚合物包裹的AuNPs在上述研究中起了很重要的作用。我们将AuNPs引入树枝状结

13、构PAMAM的内部，得到理想尺寸、组成和结构的PAMAM-Au纳米簇合物。此外，AuNPs作为一种很好的载体，十分容易与电活性物质相结合（如二茂铁），并利用自身较大的表面积、良好的生物兼容性和独特的化学性质来保持分子活性。本文以纳米粒子为载体、硫堇为电子媒介体，基于G4 PAMAM-Au纳米簇合物和纳米金功能探针，利用双信号放大技术构建的免疫传感器能够灵敏地检测-突触核蛋白。本文，首先，通过循环伏安法将邻氨基苯甲酸（o-ABA）电聚合到电极上，以提供丰富的羧基。当PAMAM-Au发生沉积时，电极表面的羧基与PAMAM-Au的氨基通过共价作用键合。然后，将硫堇修饰到电极表面，加速催化还原过程中的

14、电子传递。最后，在-突触核蛋白与PAMAM-Au/o-ABA/GCE传感器共价结合之后，依次将一抗（Ab1）和纳米金功能探针HRP-Ab2-Au修饰到电极上。通过记录不同-突触核蛋白浓度下的电流响应，实现免疫传感器的定量检测。在优化的实验条件下，该传感器在20 pg/mL 200 ng/mL的范围内-突触核蛋白浓度与电流呈良好的线性关系，检出限为14.6 pg/mL，并且该传感器具有良好的稳定性、重现性和灵敏度。该免疫测定技术在临床上用于检测生物蛋白也具有着广阔的前景。2实验部分2.1化学试剂-突触核蛋白单克隆抗体（Ab1）、牛血清白蛋白（BSA）、N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）、1-（3-二甲

15、氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、琉堇（Th）和第四代聚酰胺-胺（G4 PAMAM）均购于Sigma公司（美国）；-突触核蛋白（a-SYN，Chemicon公司，美国）；辣根过氧化酶标记的二抗（HRP-Ab2）购自北京合成生物科技有限公司；氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸三钠、硼氢化钠和邻氨基苯甲酸（o-ABA）购自国药集团（中国）； Na2HPO4、KH2PO4和H2O2（30%）购自上海化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯试剂，实验所用水为二次蒸馏水。 2.2实验仪器电化学实验采用CHI660C型电化学分析仪（美国CHI仪器公司），AJ-III型原子力显微镜（AFM，爱建公司），

16、S-4800型扫描电子显微镜（SEM，日立公司），JEM 2100型透射电子显微镜（TEM，JEOL公司），傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测定采用Nicolet Nexus 670 仪器（Thermo Nicolet公司），紫外-可见光谱（UV-vis）测定采用Cary 50紫外-可见分光光度计（Varian，美国）。使用三电极体系：所构建的免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。2.3 G4-PAMAM-Au纳米簇合物的合成G4-PAMAM-Au纳米簇合物的制备过程如下：将2mL 的PAMAM溶液（0.07 mmol/L）和2mL的甲酸溶液（1mmol/L）混

17、合均匀，然后加入2 mL 1 mmol/L的KAuCl4溶液，室温下剧烈搅拌2min，溶液逐渐由淡黄色变为红色说明有零价金生成18。2.4纳米金功能探针HRP-Ab2-Au的制备将0.01 mol/L的HAuCl4溶液0.5 mL和0.01 mol/L的柠檬酸钠溶液0.5 mL依次加入18 mL纯水中，并进行搅拌。然后加入0.1 mol/L新鲜配制的NaBH4溶液0.5 mL，溶液逐渐由无色变为橙色，停止搅拌，静置2 h。用TEM测得金纳米粒子的平均粒径约为3.5nm。将2.0 mg/mL 的HRP-Ab2溶液10 mL加入1.0 mL上述金纳米粒子溶胶中，室温下缓慢搅拌反应2 h。反应完成后

18、，在4 °C下以10000 rpm离心20 min，弃去上层清液，用PBS（0.01 mol/L， pH=7.4） 洗涤底部沉淀数次。最后，将沉淀均匀分散到500 mL含0.1 % BSA的PBS（pH=7.4）中，置于4 °C的冰箱中保存待用。2.5PAMAM-Au修饰免疫传感器的制备分别用0.3 mm与0.05 mm Al2O3悬浊液将玻碳电极（GCE， F = 3 mm）抛光至镜面，并在二次水中超声洗净，然后分别用丙酮、水超声清洗。配制50 mmol/L 邻氨基苯甲酸和1 mol/L H2SO4的聚合液，把处理好的玻碳电极放入聚合底液中，在00.97 V之间以扫速40

19、 mV/s循环扫描10圈。取出，洗净，晾干，制得邻氨基苯甲酸聚合膜修饰电极（o-ABA/GCE）。待o-ABA/GC电极自然晾干之后，在电极表面滴加10mL EDC/NHS混合液（20mg·mL-1/10 mg·mL-1），用以活化o-ABA（羧基）与NHS（酯基）的反应，30 min后用PBS冲洗，晾干。然后，在电极表面滴加5 mL PAMAM-Au溶液，1 h后再用PBS洗涤电极，晾干。最后，将4 mmol/L的硫堇溶液5 mL滴加到免疫传感器PAMAM-Au/o-ABA/GCE上，自然晾干。2.6 -突触核蛋白的固定及免疫分析将-突触核蛋白固定到PAMAM-Au/o-

20、ABA/GC电极上，步骤如下：（1）在37°C 条件下，分别把5 mL不同浓度的-突触核蛋白滴涂在PAMAM-Au/o-ABA/GC电极上，50 min后用二次水冲洗，接着将电极置于1% BSA溶液中温育30 min，以封闭非特异性结合位点，取出，水洗。（2）在电极表面滴加5 mL Ab1，于37 °C放置50 min。（3）将电极浸入5 mL纳米金功能探针HRP-Ab2-Au溶液中。（4）将电极PBS冲洗数次，置于4 °C的冰箱中保存待用。该免疫传感器的组装过程如图1所示。我们在相同条件下制作了两支不同类型的免疫电极：HRP-Ab2-Au/Ab1/a-SYN/o

21、-ABA/GC电极和HRP-Ab2-Au /Ab1/a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GC电极。Scheme 1. Schematic representation of the functioning principle of the electrochemical immunosensor for the detection of a-SYN.图1 免疫传感器的组装过程2.7 安培检测法整个实验在5 mL 0.05 mol/L的 PBS （pH 6.5）中进行，电位为-0.3 V。进行免疫测定时，向溶液中通入一定速率的N2并进行搅拌，当背景电流达到一个稳定值时，加入5 mL 1.0

22、 mol/L的H2O2。实验均在室温下进行。3结果和讨论3.1 o-ABA的电聚合如图表3所示，聚邻氨基苯甲酸（Poly-o-ABA）有以p电子为支撑的特殊结构，因此具有良好的导电性能。根据文献报道，FTIR表征结果表明聚合膜表面存在羧基。电聚合o-ABA的循环伏安图如图1所示，当以扫速40 mV/s循环扫描2圈时，电流表现了增大的趋势，说明聚合膜在增厚；当扫描10圈后，电流值平稳地增加。综上所述，本实验选择扫描圈数为10圈。 Figure 1. Cyclic voltammogram of o-ABA electropolymerizationat GC electrode. Scan ra

23、te is 40 mV s-1.图1 在玻碳电极上电聚合o-ABA的循环伏安图，扫速为40 mV/s3.2PAMAM-Au纳米复合物的表征利用甲酸、PAMAM（G4）和KAuCl4溶液合成PAMAM-Au树枝状复合物，图2A为反应前后各溶液的UV-vis吸收光谱图。从图中可知，KAuCl4在290nm位置存在一个AuCl4-的特征吸收峰，同时在220nm位置上出现强烈的吸收（曲线a）。AuCl4-被NaBH4还原之后，220 nm位置的AuCl4-吸收峰完全消失了，表明AuCl4-已经还原完全。同时，在520nm处的表面等离子体共振吸收峰为AuNPs的特征峰，表明有AuNPs形成（曲线c）。因

24、为PAMAM溶液本身存在290nm处的吸收峰， PAMAM-Au纳米复合物在290nm处也出现了吸收峰（曲线b）。从TEM照片（图2A的插图）上可以看出，由于PAMAM的存在，生成的AuNPs分散性好，粒径约为3.5nm。FTIR光谱可以证明实验生成了稳定的纳米复合物。我们比较了PAMAM（图2B曲线a）和PAMAM-Au（图2B曲线b）的红外光谱图。从曲线a得知G4 PAMAM树形分子的酰胺带的吸收峰位于1449 cm-1，而纳米复合物中由于AuNPs的存在，酰胺带的吸收带分裂成了两条，表明纳米金与酰胺基团发生了配位作用。另外，在1665 cm-1处出现了一个新的吸收峰，进一步说明AuNPs

25、与PAMAM的相互作用。Figure 2. (A) UV-vis spectra of (a) KAuCl4 solution, (b) PAMAM solution, and (c) PAMAM-Au nanocomposites in their aqueous solution. Inset: TEM images of Au nanoparticles with resolution of 5 nm. (B) FTIR spectra for (a) PAMAM and (b) PAMAM-Au nanocomposite.图2 （A）紫外可见光谱图：（a） KAuCl4 溶液；（b）

26、 PAMAM溶液；（c） PAMAM-Au纳米复合物的水溶液，插图：AuNPs的TEM图像（分辨率5 nm）。（B） 傅里叶变换红外光谱图：（a） PAMAM； （b） PAMAM-Au纳米复合物。3.3 AuNPs和纳米金功能探针HRP-Ab2-Au的TEM表征用TEM表征AuNPs （图 3a） 和HRP-Ab2-Au （图 3b）的形态学和微观结构。粒度分析表明，在HRP-Ab2和AuNPs结合前，粒子的平均粒径只有4.2nm，结合后的平均粒径增大到了15.6nm。由于大量的HRP-Ab2覆盖在AuNPs表面，图像中的粒子存在阴影。Figure 3. TEM images of Au n

27、anoparticles before (a) and after (b) the formation of the HRP-Ab2-tagged Au-based bioconjugates.图3 HRP-Ab2-Au形成的前（a）后（b）AuNPs的TEM图像3.4免疫传感器的AFM表征利用AFM来研究裸玻碳电极、o-ABA/GC电极、PAMAM-Au/o-ABA/GC电极和a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GC电极的表面形貌。如图4A所示，裸玻碳电极的表面非常均匀（电极表面高度为25.9 nm），发生o-ABA电聚合后，表面高度接近40.9nm（图4B）。PAMAM-Au/o-A

28、BA/GC电极表面显得非常粗糙，表面高度增大到60.0nm （图4C），实验制得的免疫传感器a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE的表面高度最大，达到了799.9nm（图4D）。图4D的表面非常平滑，可能是因为-突触核蛋白分子填充了纳米复合物之间的空隙。Figure 4. Typical three-dimensional perspective view of AFM images of the glass carbon electrode surface at different steps of a-SYN immobilization: (A) bare GCE; (B) o

29、-ABA/GCE; (C) PAMAM-Au/o-ABA/GCE; (D) a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE.图4 玻碳电极表面的AFM图：（A）裸玻碳电极；（B）电极o-ABA/GCE ；（C）电极PAMAM-Au/o-ABA/GCE ；（D）电极a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE。3.5免疫传感器表面的电化学性质利用电化学阻抗 （EIS）来探测修饰电极的表面特征，是一种方便有效的研究方法。玻碳电极上逐层修饰的阻抗表征图谱如图5A所示：裸玻碳电极的阻抗值很小（曲线a）。当修饰了o-ABA后，电化学反应阻抗Ret明显增加（曲线b），这是由于聚邻氨基苯甲酸分子结构阻

30、碍了电子的传递，它同时也证明了o-ABA在电极表面成功发生了电聚合。与裸玻碳电极（曲线a）相比，PAMAM-Au/o-ABA/GCE电极由于表面的PAMAM-Au/o-ABA膜，增强了Fe（CN）63/4在电极表面的电子传递，所以表面电子传递电阻减小（曲线c）。当a-SYN结合到PAMAM-Au修饰电极表面上后，阻抗Ret明显增大（曲线d）。最后，由曲线e、f可见，当电极表面依次修饰了一抗（Ab1） 和纳米金功能探针HRP-Ab2-Au之后，氧化还原过程的电阻都相应地增加，阻碍了电子转移。图5B为玻碳电极上逐层修饰的循环伏安图，实验结果与EIS完全一致。Figure 5. (A) Nyquis

31、t plots of the electrochemical impedance spectroscopy (EIS) at its formal potential with amplitude of 5 mV and frequency range of 0.1 Hz to 100 kHz and (B) cyclic voltammograms for fabrication steps: (a) bare GCE; (b) o-ABA/GCE; (c) PAMAM-Au/o-ABA/GCE; (d) a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE; (e) Ab1/a-SYN/PAM

32、AM-Au/o-ABA/GCE; (f) HRP-Ab2-Au-/Ab1/a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE; which were measured in pH 7.4 PBS containing 2.5 mM Fe(CN)63/4.图5 （A）电化学阻抗图谱；（B）循环伏安图： （a） 裸玻碳电极； （b） 电极o-ABA/GCE ；（c） 电极PAMAM-Au/o-ABA/GCE ；（d）电极a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE； （e） 电极Ab1/a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE ；（f）电极HRP-Ab2-Au/Ab1/a-SYN/PAM

33、AM-Au/o-ABA/GCE。以上实验均在含有2.5 mmol/L Fe（CN）63/4的 PBS（pH 7.4）中进行。3.6实验条件的优化在免疫分析中，温度和孵育时间在很大程度上影响着免疫传感器的灵敏度。将制备好的免疫传感器放入10 ng/L -突触核蛋白溶液中，用循环伏安法测定不同温度的响应电流，如图6a所示。实验发现，在含1.0 mmol/L的 H2O2溶液（pH 6.5）中，电流响应在10°C 37°C之间随着温度的升高而增大，在37°C时，免疫传感器表现出最大的响应电流，而当温度高于37°C以后，电流响应反而下降，这很可能是因为部分酶的变性

34、失活。故本实验选择温度为37°C。同时研究了反应时间对免疫传感器响应特性的影响（图6b）。在37°C条件下，免疫传感器的电流值在孵育50min后趋于稳定，此时免疫电极上结合的抗原量达到饱和。因此本实验选定孵育时间为50min。调节PBS的pH值，考察了溶液pH值对传感器响应电流的影响（图6c）。实验表明pH在6.5左右电极的响应最大。随着溶液pH值从5.0到6.5的增加，响应电流急剧增大，而当pH值高于6.5时，电流逐渐减小。因此，本实验选用实验溶液pH为6.5。Figure 6. Effects of (a) incubation temperature, (b) inc

35、ubation time, and (c) pH of detection solution on the electrochemical responses of the immunosensor toward 10 ng mL1 a-SYN in pH 6.5 PBS containing 1.0 mM H2O2.图6 （a）孵育温度、（b） 孵育时间和（c） pH 对传感器的影响3.7免疫传感器的电流响应在最优的实验条件下，利用PAMAM-Au和纳米金功能探针HRP-Ab2-Au的双信号放大技术，通过电流时间曲线法测定了-突触核蛋白的浓度。本实验分别使用三支不同的免疫电极对各个浓度的-突

36、触核蛋白进行平行实验。从图7可以看出，当-突触核蛋白浓度逐渐增大时，响应电流也相应地增强，这可能是因为电极表面结合了较多的HRP-Ab2-Au（图7插图）。-突触核蛋白的浓度在20 pg/mL200 ng/mL的范围内与响应电流呈良好的线性关系。线性方程为y = 0.3083x + 0.0215，相关系数为0.9968，检测限为14.6 pg/mL。Figure 8. Linearity obtained with HRP-Ab2-Au-/Ab1/a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE immunosensor analyzing with different concentrati

37、ons of a-SYN under optimized conditions (same conditions as in curve b of Figure 5B). Inset: Amperometric responses of the immunosensor in PBS (pH 6.5) in the presence of (a) 0, (b) 0.05, (c) 0.1, (d) 0.2, (e) 1 ng mL1.图7 响应电流与a-SYN浓度的关系曲线图；插图：免疫电极在（a） 0，（b） 0.05，（c） 0.1，（d） 0.2，（e）1 ng/mL PBS缓冲液（pH

38、 6.5）中的响应电流3.8传感器的重现性、稳定性和再生性制备三支相同的传感器进行重现性实验，分别对10 ng/mL的-突触核蛋白进行测定，相对标准偏差为1.2%。这是可以接受的再现性和精确度。通过记录一个月内每个星期的响应电流来测量免疫传感器HRP-Ab2-Au-/Ab1/a-SYN/PAMAM-Au/o-ABA/GCE的稳定性，该传感器保存在4 °C的PBS缓冲溶液中。在一个月的放置之后，通过安培法测定，我们观察到抗体识别的活性损失不到7.2%，表明该免疫传感器稳定性高。用pH=2.8的Gly-HCl膜再生液冲洗传感器，用以阻断抗原和抗体的免疫复合体，这就是免疫传感器的可再生性。

39、免疫分析后，将电极浸入pH=2.8 的Gly-HCl溶液 10 min。在含Ab1的溶液中再孵育电极，然后在HRP-Ab2-Au悬浮液中引起了相同的响应电流。在6次实验之后，更新的免疫传感器能够恢复初电流的95.8%。4结论本文采用双信号放大技术，引入PAMAM-Au纳米簇合物及金纳米粒子生物探针，成功构建了高灵敏度的电化学免疫传感器。本实验通过循环伏安法，于酸性溶液中在玻碳电极表面电聚合了o-ABA膜，为聚合物表面提供了充足的羧基。然后，将HRP-Ab2-Au引入电极表面，通过PAMAM-Au纳米簇合物及信号放大技术，增加了靶抗原在电极表面的固定量，增大了检测的灵敏度。在免疫测定过程中，将大

40、量的HRP-Ab2与AuNPs相结合，从而实现了检测信号的放大。该传感器制备过程简单，灵敏度较高，具有较宽的线性范围和较低的检出限，电极的重现性和稳定性良好。因此，采用该法制备的免疫传感器在重要蛋白质的临床分析和生物分析等方面具有广阔的应用前景。参考文献(1) Vigneshwaran Mani, Bhaskara V. Chikkaveeraiah, Vyomesh Patel, J. Silvio Gutkind, James F. Rusling, ACS Nano, 2009, 3,585-594(2) Peruski, A. H., Peruski L. F., Jr. Clin.

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