鸡蛋清蛋白酶解物中抗氧化多肽的纯化与特性描述

1、食品化学, 188（2015）467-472鸡蛋清蛋白酶解物中抗氧化多肽的纯化与特性描述吴健平（笔者） 摘 要 蛋白被认为是一个富含优质蛋白质与各种小分子生物活性肽片段，酶解蛋白法用来释放蛋白中不同的生物活性的小分子肽，这取决于不同的酶在释放这些生物活性肽时有不同的酶活力。在这项研究中,测定了几种蛋白酶从鸡蛋白中释放抗氧化肽的能力，蛋白酶P是根据抗氧化活性和粗蛋白水解物的消化率而选择。结合几个净化步骤包括与低分子量截止膜超滤阳离子交换色谱和反相高效液相色谱法等用于净化蛋白酶P的水解产物，来自卵白蛋白的16个抗氧化肽,卵转铁蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制物与有效部位是相隔离的。这些多肽的氨基

2、酸序列的测定使用LC- MS，短链多肽的自由基吸收能力(ORAC)值用来决定合成多肽。两个肽AEERYP 和DEDTQAMP(Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro和Asp-Glu-Asp-Thr-Gln-Ala-Met-Pro)显示ORAC值最高。这项研究的结果表明,鸡蛋清蛋白富含抗氧化肽，使用酶解纯化技术可将鸡蛋清蛋白作为制备生物活性成分的潜在来源。关键词：鸡蛋白；酶解；超滤作用；层析分离；抗氧化肽1.背景介绍 食源性的生物活性化合物,如生物活性肽,- 3脂肪酸,类黄酮、酚类化合物等,是一项主要集中在食品科学领域和营养科学领域的研究。这些化合物具有抗高血压、抗氧化,抗炎,抗菌,免疫

3、调节和其他生物相关活动，很可能有利于人类的健康和幸福(刘,2004;锅。赖,Dushenkov & Ho 2009;Sacks等,2006)。因为氧化应激相关的各种慢性疾病的发生和发展,抗氧化剂已经被普遍的探索，以期成为一个可能降低慢性疾病的风险的治疗物。尽管生理上控制自由基的生产对许多信号通路和正常功能来说是必不可少的，自由基的形成之间的不平衡和内源性抗氧化系统将诱导氧化损伤生物分子，导致细胞的损伤和疾病(哈利维尔,1994;Pacifici&戴维斯,1994;Sarmadi &伊斯梅尔,2010;Soobrattee,Neergheen,Luximon-Ramma,

4、Aruoma,& Bahorun,2005)。此外,抗氧化剂被认为扮演一个角色在预防或延迟自氧化食物组成部分，被广泛应用于不同的商品(Shahidi &钟,2010)。 植物化学物质如酚类化合物和黄酮类化合物是众所周知的抗氧化剂，抗氧化肽,由于其营养价值和可能的功能性质,如乳化和起泡,相比于植物化学的抗氧化剂存在额外的优势由于其营养价值和可能的功能性质,如乳化和起泡,相比于植物化学的抗氧化剂存在额外的优势(谢,黄、徐&金,2008)。因此,现在越来越多的人致力于开发抗氧化肽.生物活性肽当作为母蛋白的一部分存在时通常不活跃，但可以在食品加工和光解、水解后释放，肽的大小和组

5、成决定其抗氧化和自由基清除属性(郭,Kouzuma并,2009)。抗氧化肽已报告来存在于大豆蛋白(Chen村,山内,& Nokihara 1996;Moure Dominguez,& Parajo,2006),小麦蛋白(朱,周&钱,2006;王,赵,&江,2007),鱼蛋白(Bougatef et al .,2010;我,钱,Byun,&金2007;金,我,和金,2007),牛奶(Pihlanto,2006),和蛋清蛋白(Davalos,米盖尔,Bartolome & lopez-Fandino,2004;沈,查哈尔,Majumder,你和吴,2

6、010;你和吴,2011)。 鸡蛋白是一个很好的的优质蛋白质来源,也是一种很好的生物活性肽的来源。一般来说,准备一种或几种蛋白酶用来水解蛋白，水解的蛋白液将受到一系列的净化措施和生物活性试验来分离有效的生物活性肽。抗氧化肽是以胃蛋白酶消化蛋白水解物(YAEETYPIL和萨拉姆)(Davalos et al .,2010)。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶、玉米胚芽蛋白酶解物的溶菌酶(Memarpoor-Yazdi,asoodeh &Chamani 2012)和卵清蛋白(徐,上官,Wang &陈,2007)为特征的。产生更强的抗氧化肽,必须使用合适的蛋白酶水解蛋白的蛋白质。我们准备蛋白玉米胚

7、芽蛋白酶解物显示较低的抗氧化活性比由胃肠蛋白酶(你和吴,2011)。尽管胃肠道酶已经被广泛研究来生产蛋生物活性肽，预备蛋清蛋白抗氧化肽的潜力尚未充分探索,目前还不清楚是否其他蛋白酶可能用从鸡蛋蛋白中产生更有效的抗氧化肽。此外,许多肽没有特点。因此,这项研究的目标是确定适当的蛋白酶来得到蛋清蛋白水解物,进一步净化和描述抗蛋白抗氧化肽的特征。2.材料和方法2.1.材料 蛋清蛋白粉,偶氮二异丁基盐酸脒(2-methylpropionamidine)二盐酸物(APPH),荧光素和水溶性的维生素E从穿越有机物中获得(美国新泽西州莫里斯平原).蛋白酶P“安满能”6(来自曲霉菌)蛋白酶M “安满能”(来自曲

8、霉罗纳水稻变种。)和蛋白酶S”安满能” “G(来自嗜热脂肪芽孢杆菌)都由安满能制药有限公司提供(日本名古屋)，风味蛋白酶,(来自曲霉变种。)从杰能科国际、丹尼斯克(罗彻斯特,纽约)的一个部门中获得.碱性蛋白酶(来自地衣芽孢杆菌)从Sigma-Aldrich处购买(奥克维尔,加拿大),酶活性和工作条件列在表1.令人感兴趣的多肽被GenScript(皮斯卡塔韦,NJ)化学合成了，并且用液相色谱仪检测出大于 95%。2.2准备蛋清蛋白水解液蛋清蛋白粉添加到蒸馏水获得50毫克/毫升(w/v)蛋清蛋白溶液,混合液在90加热10分钟连续搅拌,避免凝胶,然后PH值和温度调整到酶水解的最适值(见表1.条件稳定

9、时,酶的添加比例的25:1(w / w,蛋清蛋白酶)夹套烧杯中的所有消化在恒定的温度和Titrando循环水浴下进行(瑞士万通、Herisan、瑞士)用0.5 M氢氧化钠或0.5 M HCl保持恒定的PH值.水解3 h消化后,在95加热10分钟终止酶水解活动,水解液在离心机中以10000重心转下离心25分钟，取上层清液冻干,用于进一步分析消化率收益率计算是基于下列方程(戴伊&多拉,2014)。消化率(%)=(离心后体重的蛋白质水解物)/(重量的蛋白质被消化)* 1002.3.蛋白水解液中抗氧化肽中的净化提纯2.3.1.超滤过滤P蛋白酶水解液通过超滤分离，使用膜和分子量切断(MWCO)3

10、000 道尔顿(美国微孔).渗透、冻干用于进一步净化。2.3.2.阳离子交换色谱法渗透(3 千道尔顿)溶解在o.o1M乙酸铵缓冲，保持100毫克/毫升的浓度和从0.2m过滤器和在阳离子交换柱(16 * 100毫米,HiPrep 16/10 SP FF,通用电气医疗集团) 中进行阳离子交换色谱分析,操作系统为AKTA exploer 10 xt(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典).用10毫米醋酸铵(pH值4)平衡柱子(CV),大于5个柱子体积然后4毫升的样品注入到柱子中.2.3.3.反相高效液相色谱 肽分数显示最高的抗氧化活性阳离子交换层析进一步纯化后用反相高效液相色谱法(反相高效液相色谱)在X

11、bridge C18柱(10 * 150毫米,5m自动进样器，Milford,MA,USA) 配备了2702 thermoautosampler，一个二进制梯度泵和一个2998光电二极管阵列检测器。0.1%的样本筛选了组织在水中(A)和100%的乙腈100%组织(B)使用2% B超过5分钟,然后在45分钟增加到25%,50%在5分钟,5分钟1 oo % B,B在5分钟和呆在2% 2% B条件另一个5分钟的流量3.0 ml / min。总共有16个分数筛选了,发现22 nm和分数然后冷冻干燥。氧自由基吸收的部分进行测试活动，将最活跃的部分进一步纯化在同一列上使用20mM磷酸缓冲盐(PBS)在水里

12、有0.05%的组织作为流动相,20mM PBS 在以下梯度的80%乙腈：在0 - 15% B5分钟,待在15% B 10分钟,15 - 0% B 5min 和平衡列100%另一个10 min.Flow率为3毫升/分钟在220 nm和监控。九个分数收集、冻干和活动的决心。用100% A平衡柱子10分钟。流量是3毫升/分钟在检测孔径220nm。9个部分被收集，冻干干燥，抗氧化能力被确定。2.4.抗氧化试验2.4.1.抗氧化活性指标测定 抗氧化活性指标测定试验在黑暗中进行演示，未经过处理的96微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)根据方法或牛津大学Hampsch-Woodill和之前(

13、2001)和经过Dabalos的修改等。简单地说 ，四种不同浓度的样本准备在75mM磷酸盐缓冲剂(pH 7.4)与50l荧光素混合(200nM)并在37孵化10分钟。Trolox(2-16M)用来做标准曲线。然后，每孔加入50微升APPH(80mM)，用自动震荡器对每块板机械震动5秒。用荧光度用荧光标进行读取记录(FLuoroskan Ascent;Thermo Electron Corp,Vantaa,Finland)每隔1分钟为99分钟的激发下发射出波长为485 - 538纳米地单一波长。所有试验都应有一个空白对照同时进行，用色氨酸进行积极控制。每个样本的曲线下的面积(AUC)可通过集成的

14、相对荧光曲线进行计算，回归方程Trolox和样本抗氧化活性指标值的计算是通过在同一试验中样本斜率比Trolox斜率获得的。最后抗氧化活性指标值表示为微克分子的Trolox每毫克样品当量(mol TE/mg)。2.4.2.清除自由基的活性测定ABTS法是基于对2,2'-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐上的阴离子的清除(ABTS-)通过抗氧化化合物和参照Re的方法进行。(1999)有细微的修改。ABTS由混合的ABTS原液(7mM)和过硫酸钾(2.45mM)在磷酸缓冲盐(PBS,pH7.4)和混合物在室温下避光保存16-17h产生的。将稀释液涂在96微孔板中(Costar #

15、9017,Corning,Inc,NY)和四个不同的样品浓度被使用。用100l ABTS+稀释液进行反应(absorbance0.7 at 734nm )。在37孵化8分钟后测734 nm处吸光度（spectramax 190,Molecular Devices Corporation,CA)绘制出样本曲线。标准曲线是测一系列浓度的混合Trolox(0、2、4、8、12、16和20m)与100lABTS+稀释液而得出。ABTS值计算的基础为trolox曲线，表达为表示为微克分子的Trolox每毫克样品当量(mol TE/mg)。2.5液质联用仪 抗氧化活性最高的部分在第二次高效液相色谱净化在C

16、18墨盒中脱盐，根据shen et al.(2010)描述的方法使用超高压液相色谱系统连接 Waters(Micromass) Q-TOF Premier (Milford,MA,USA)进行液质联用仪分析。 研究资料搜索引擎为Mascot搜索引擎(），山峰查看器4(Bioinformatics Solutions Inc.,Warterloo,ON,Canada）结合使用手册从头测序、处理MS / MS数据和执行肽的顺序。2.6数据分析 所有结果被表示为平均值±(SAS version 9.0,SAS Insitute,Cary,NC)。平均值用Duncan的倍数范围检验

17、p < 0.05。3.结果与讨论3.1.蛋白的酶消化和抗氧化活性 使用各种酶水解蛋白如图表1。氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity)和ABTS试验是用来评估不同样品的抗氧化活性。不同的活动和消化收益率水解结果表明作用裂解点不同的酶水解鸡蛋白会产生不同的肽数量。酶P和酶M水解试验表明最高的氧自由基吸收能力和ABTS活性是1.28和1.61,1.30 和1.94molTE/mg，各自的。蛋白酶水解P显示更高消化率为93.3%,被选中进一步纯化。3.2. 纯化鸡蛋白水解液中的抗氧化肽 众所周知低分子量肽(2-20 aminoacids)生物活性

18、比亲本多肽/蛋白质大(Chen, Yang, Sun, Niu, & Liu, 2012; Kitts & Weiler, 2003; Shahidi&Zhong, 2008)。而且，他们更耐胃肠道消化和有更高的机会通过肠道吸收膜(Sampath, Nazeer, & Jaiganesh, 2012; Sarmadi& Ismail, 2010)。超滤是一种获得原油的低分子量天然蛋白酶解物的有效的净化方法。3 kDa的水解受到超滤膜和渗透在阳离子交换层析进一步纯化获得的。受到3 kDa的超滤和渗透膜超滤，在阳离子交换层析获得进一步纯化。四个结果分数(Fi

19、g. 1)为氧自由基吸收活动测试。游离份数(F1)显示,改进的活动与,蛋白酶水解P相比，这个分数(F1)是被用于进一步净化。 F1是在高效液相色谱柱纯化，总共有16个分数被获得和测试氧自由基吸收活动(Fig. 1)。第7部分，显示出2.81 µmolTE/mg的最高氧自由基吸收活动受到了第二次高效液相色谱分离和九个氧自由基吸收值的分析。第二次高效液相色谱的九个分数中的五个分数显示提高的抗氧化活性。分数2, 3, 4, 和 6 (named as F1-7-2, F1-7-3, F1-7-4, and F1-7-6 respectively)显示氧自由基吸收活动值3.33, 3.31,

20、 3.16, 和3.10 µmol TE/mg的各个样品。这些分数被受到肽鉴定。总共16个肽来源于卵清蛋白、卵铁传递蛋白分数和半胱氨酸蛋白酶抑制物来自F1-7-2, F1-7-3, F1-7-4, and F1-7-6 (Table2)的特征。一般有报道更小的肽具有更强的抗氧化活性相比,更大的肽(Guo et al, 2009)，因此从化学合成中选择短链多肽，测定他们的抗氧化活性(Table3)。 两个卵清蛋白衍生肽,EERYP(Fig. 2)，与AEERYP 有共同的主题序列的YAEERYPIL肽，这是之前报道中的一种非常有效的抗氧化肽(Dava1os et al. 2004)。虽

21、然这两个肽在先前的文献中没有报道他们的抗氧化活性,肽含有相似的序列,YAEERYPIL，以胃蛋白酶水解蛋清水解液为例，显示一个氧自由基吸收值的3.8µmol TE/µmol(Dava1os et a1., 2004)。我们的研究证实,AEERYP显示最高氧自由基吸收值为3.32±0.07µmol TE/µmol(4.35± 0.09 µmol TE/mg)，类似于之前确认的YAEERYPIL。损失的N端酪氨酸和羧基端Ile-Leu不会改变活动太多。然而，N端丙氨酸损失导致EERYP收益率活性降低到1.53±0.02

22、µmol TE/µmol(Table3)表明N端丙氨酸抗氧化性质的重要性。疏水性氨基酸残基的存在例如： 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者异亮氨酸在它们的N端已被确认有一个典型的抗氧化肽的结构特征(Guo et a1., 2009; Sarmadi& Ismai1, 2010)。 两个多肽DEDTQAMP(Asp-Glu-Asp-Thr-Gln-Ala-Met-Pro; 3.14±0.1 µmol TE/µmol)和PVDENDEG(Pro-Va1-Asp-Glu-Asn- Asp-Glu-Gly; 2.46±0.1 µmol TE/µmol)分别从卵清蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制物中得到，也显示出高氧自由基吸收值。脯氨酸终端存在在两种肽中是常见的结构特征。此外，酸性氨基酸残基的出现例如As