因表达相对定量RESTC软件分析与2△△CT法比较

1、 956 -文震编号16723619(2007)KM)95M)3Journal of Tropical Medicine Vol.7 No. 10 Oct.2007基础研究论著实时RT-PCR基因表达相对定最REST©软件分析与2(两)法比较泌、刘建平 庄志雄-杨淋清(.张仁利-叶小明，.程锦泉"(1深圳市疾病預防控制中心分子生物学研亠亠 2?华中科技大学同济医学陀公共卫生学I人晦用达【摘要】目的 利用实时RT-PCR技术逮立一种简便、准确的基t 支气管上皮细胞株(16HBE) cDNA为棋板5倍系列稀释，分別作DN (GAPDH)标准曲线。以不同剂量反式二胫环氟笨并(an

2、ti-BPDE 及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板，进行实时定量RT-PCR。以GAh相对定位。实验数据分别采用2s)法及REE软件分析。结果5倍系列桥释法制作的标准曲线呈现较好 的线瑕关系(Rsq 0.997)o POLK及GAPDH菇因扩增效率分别为117.5%和103.5%o采用2法卄算出的表达 比值均比REST0软件分析高"结论 实时RT-PCR技术结合REST软件分折是一种简便、准确的基因表达相财 定昱分析手段。【关键词】实时RT-PCR；相对定就；标准曲线；基因农达中图分类号:R446.61 文猷标识码:AQuantitative Analysis of Real-

3、Time PCR Expression Productionby REST© and 2(")YU Lei1, UU Jian-ping1-2, ZHUANG Zhi-xiong1, YANG Lin-qing ZHANG Ren-li1,YE Xiao-ming19 CHENG Jin-quanle(/. Shenzhen Center for Disease Control and Prevention 9 Shenzhen 518020； 2. School of Public Health 9Tongfi Medical College Huazhong Unive

4、rsity of Science and Technology 9 Wuhan 4300309 China)Abstract Objective To develop a simple and accurate method for the quantificalion of real-time KT-PCR gene products. Method Standard curvet of POLK and GAPDH genes were made from 5-fold serially diluted cDNA samples from the normal 16HBE cells. T

5、he levels of POLK mRNA in the malignant transformed 16UBE cells and human lung cancer cells (H1299) treated with various concentTaiiofw of BPDE were determined. GAPDH gene was used as the rcfeimce gene. The relative expression levels were analyzed by REST。and 2'a)method. Result A good linear rel

6、ationship ( Rmj 0.997) was obtained from the slandard curves The efficiency of amplification of POLK and GAPDH genci» was 117.5% and 103.5%, respectively. The expwwion ratios calculated by wing 2<'4ACT) method were higher than the rations obtained from the REST® Condusioo Real-time

7、RT-PCR in combination with REST® is a simple and accurate method for relative quantification of gene exprowion.Key words) real*time RT-PCR； relative quantification; standard curve； gene expra>sion分子流行病学研克中一个非常重要的内容就是在群 体研究茶砒上,从分子或基因水平探索疾病的病因和发病 机理。目前实时RT-PCR已成为基肉表达定董的强有英金驸目：深圳I市科技计划頊目(No.TH2

8、0050530(M99A)o 作青筒介：W«(1964-)t女博士 剧主任賞師主宴从事生物化 学与分子瘴理学研究。通饥作奢:程侃泉.博士主任医师.E-mail： cjinquan«oha.CTMD力的工具，具有高敏性好及定fit范俺广的待点待 别是定徽低丰度的mRNA及揭示微小的基因表达变化叫 由于其操作简单而彼广泛应用但传统的法定童误菱 大本文介绍丁一种简便、准确的站因表达相对定傲实 时RT-PCR方法包括标准曲线的制作及实验数据的处理。1材料与方法1.1材料采用的细胞株为永生化人支气管上皮细胞株(16HBE)。 957 1611BE.anti BPDE转化的I6HBE及

9、肺癌H1299细胞和 BPDE境品由广州医学院化学致鴉研丸所纪卫东博士瞬送。1.2方法121细胞培养及诱导16HBE细胞用含10%小牛血清 的MEM培粹液培养。Anti-BPDE诱导:antiBPDE需存液 （OMSO溶解）用含10%小牛血清的MEM培养液稀释成 绊浓度分别为0.25.05 J >unol/L的洛液。待细胞长至 80%融合时弃上清，加入含BPDE的堆养液诱导24九 用PBS洗23次细陋按1:1传代待细舱长至80侥融合 时，再加anti-BPDE诱异共3次，以10%小牛！ftl清MEM 培养液作为对照。1.2.2总KNA提取 收集细胞，用TRhd试剂（Invitrogen

10、Life Technologies公可产品），按照试捌盒操作步骤提取总 RNA。1.2.3 cDNA合成 以各处理组的总RNA为模板进行逆 转录反应。采用ExScrip产RT-PCR试剂盒（TdGRa公 司）。20 口反应缓冲依妖含病机引物（Random 6 mera）50 pmol/L、逆转录科（ExScrip产RT*） 50 U.KNA醉抑制剂 10 叭 dNTPs 各 0.5 mmol/L 及总 RNA 1 口。于 PCR 仪 （Gene Amp PCR Sydlein 97001 Applied Bioeystems 公司产 品）42* 15 01111,95%： 2 mino1.2.

11、4实时定£ RT-PCR基因表达分析1.2.4.1 TaqMan MGB«针及引物设计 基因表达分析的 引物、探针用 Wmer Express 软件（Applied Biosydtems 公司 产品）设计（表1）由丄梅幕康主物技术公司合成。»1甚因寰达分析的引笹探针序列Tab.l Summary o< the assays wed in gene expresioo个样本设3个复几同时设置无模板对照（NTC）o以G4PWZ基因作为内参照进行POLK基因表达相对定仪器软件 （Straugene公司产招）自动分析给岀基因相对表达盘 （Relative quant

12、ity）或表达比值（Expression ratio=2<'CT）0 1.2.5数据分析 实隸数据分別采用下列2种方法分析。2（s）法：仪器软件自动分析给出表达比值使用分析：在相丿 值软件分析ZfiQ2结果2.1标冷曲以正常5倍及10倍系列稀释制作尺儿K和GAPDH基凶标瓶曲线结果 表明5倍系列稀释呈现较好的线型关条（Rsq 0.997）。 POLK及CAPDH基因扩增效率分别为117.5%.和103.5%, 基本一致（图1,图2）。0.52 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 3S 4004» 尸 MM引39

13、探针（5 J 3）CAPDII CCATCAATCACCCCTTCATTCCATCGCTGCAATCArATFGCAACrcCTCA ACTACATCOTr ACP -AIUlVtlAAllll ItllArGAUAAlV tAlUA-LAALLlUAAibr GCTCTCTCTGGCECTGAACA :F代衣FAM.P代表MCBX团BB1 2LK标*曲銭的扩壊曲钱Flg.l AmpHflotton curves rf POLK gene standard curves1.2.4.2实肘定诫RT-PCR 采用Premix Ex加恥试剂盒 （TaKaRa公可产品）。25反应缓冲体系含引物各0.4

14、junol/L.探针 02 toI/L.ROX 参考染料及 cDNA 1 口。 反应奁MM000荧光定MPCR仪（Straiagee公司产品）上 进行。反应条件：95弋預变性10 “再95P 5叭60丫 30片 40个循斤。-1.2.43 标准曲线的制作 以正t 16HBE cD«A为棋板 分別进行2、5、10倍比稀释。如5倍系列稀释:1 ”S叫 讯、5七5二分别作X?山和GAPDH祕标准曲线。反应 体系及条件见I.2.4.2,仪器软件（Sen血妙匕谷司产品）自 动分析给出扩堆效率（PCR Efficicy,E»10>-!）o 1.2.4 4基因衷达相对定債分析血不同

15、剂fi anti-BPDE 诱导的16HBE、miBPDE转化的16HBE及肺癌H1299细 胞cDNA为楔板，进行实时定fit RT-PCR.参见1242。毎S2 POLK因标准曲坟Flg.2 Standard curves of FOUL gene2.2 POLK基因相对定分析实验数据分别采用2（f 法及REST9软件分析（表2）。如肺癌H1299慕兴表达比值采用2（士唯计算为549, 而采用RESlt软件分析为3.71,可见采用2cs医分析的 表达比值均比REST*软件分析高。热带咲学杂去2007年10月第7卷第10期 958 Journal of Tropical Medicine V

16、oL7 No. 10 Oct.2007«2 POLK基因相对定表达比值Tab.2 The rdativt odds nfim of POLK gtnt expression样本剂«(pmol/L)衣达比值(Pffl)2<->RESTO1E 常 16HBE1.00L00nti.BPDK 3 次诙9 16MRE0 253.86(0.039)2.50(0855)0.54.33(0.005)2.88(0.887)12.63(0.237)1.85(0.726)H12995.49(0.000)3.71(0.660)anti-BPDE 转化 16HBE2.25(0.407)1

17、.56(0.985)3讨论采用实时RT-PCR技术进行基因表达分析包括绝对 定童及相对定虽法。由于研究君多关注目的基因的表达变 化即实验组与对鹽组目的碁忸表达比值的变化。相对 定St法已成为基因表达分析最常用的手段。目前市面上侑 售的荧光定 fit PCR 牧如 Stratagrne 公可、Applied Biosytftrnw 公司等多采用的相对定域法。臾其将PCR的扩增效 率设定为1 但实际的扩增效率不可能达到丨陨此该法计 算出的相对定fit结果通常比实际结果要离。REST0 软件(rejUive expression software tool)是专门 设计用于实时RT-KJR技术相对定

18、试基與表达分析。 其具有如下优势：PCR扩增效率的修正，表达比值9 卄算包括了目的垃因及参号里因的扩增效率.结果更准 确，并不一定要像法要求耳的基因及簽考基因的扩 增效率一致;统计学分析，采用简单的统计学随机检验 (randomization test),克服了传统统计学分析的复杂性特 別是能用于组间(如实验组与对照组)务个基因表达分析。 本文采用TaqMan MCB探针实时RT-PCR法相对定fit POLK基因表达，将*3法与RES”软件分析进行了比 较，表明采用2亠6法计算的表达比值均比RESTO软件分 析高。FaiohB等播岀若目的基因与參考基因的扩增效 率相差超过5%最好采用REW软

19、件分析。采用实时RT PCR技术相对宦就基因表达，关键一步 就是标准曲线的制作即获得标准曲线的斜率计算扩增 效率。一般仪器说明书建议使用2倍稀释法。本文分别 用 了 £" Hr 12. / 2 £ iM XK 丘 4 vwr Xn PDfJ基因标准曲线型关系(Rsq0.9总之二结合泉一种简便J1 俞噸衣陈声林.我国分子淹行病学研究进WJ.中华潦 行病学聚匕2000, 21(5)： 383-3862 PFAFFL MW, HORGAN CW. DEMOTE L. et al. RdMive expression software tool (REST) for gr

20、oup-wise comparison and Katiytical Analysis of rehtive expedition reeuite in rctl- time PCRfJ). Nuclek Acds Res, 2002, 30 (9)； e363 张弛宇檢喉U«f*. 一种紙颖简便的荧光实时RT- PCR相对定方法的建立J生物化学与生物物理逬展. 2005, 32(9)： 883-8874 江庆詔李瑣元曾岭等抡腋二甲双肌时菲洒箱性册 防胖大艮庸肪组织肿制坏死因子a墓因表达的影响J. 中山大学学报(医学科学版).2006 , 27(4). 383-3865 FA1OLA

21、 B. FUI4JEK E3. W0«G VA. & al. Gene expzlon profile in bone marrow aid hematopoietic «tem cells in mice expoeed to inhaled benzeie J. Mutadon Rest 2OO4v 549 (U2)： 195-2116 Mx4000TM Multiplex Quinlitative PCR System In&tn>ction Anual： 119-120.(收稿 fl 期：2(«7-05-23：修回日期：2007-07

22、-06)(上按第947頁)reaponse at m *pSen lymphocyte*J. Neunoeci Ret. 1987. 18： 134-139.14 OTTEN Ut EHRfURD P, PECK R. Nerve growth (actor induces growth and diflerratiation (/ human B lymphocytes J仏 Nad Acad Sci USA. 1989 , 86： 10059-10063.15 KIMATA H, YOSHIDA A, (SHIOKA C. & al. Nerve growth factor spedflcaDy indocet human lgG4 production J. Eur lmmmol, 1991, 21； 137-M1.16 HAMADA A, WATANABE H9 OHTOMO H Nerve growth fiar enhances oundval and cytoto