食品中蜡样芽孢杆菌检验

1、食品中蜡样芽孢杆菌检验 1.1生物学特性 (1）形态特征属是一大群需氧的革兰氏阳性杆菌，菌体杆状，大小为（0-1.3)um×(3-5)um；有一个或数菌体为球状，不形成丝状体，形成内生孢子。以侧生鞭毛或周生鞭毛运动，或不运动。兼性需氧能形成不突出菌体的芽孢。菌体两端较平整，多数呈链状罗列，与炭疽杆菌相像。周生鞭毛，能运动，无荚膜。 (2）培养特性蜡样芽孢杆菌生长温度为25.37，最适生长温度30-32 , 10以下停止繁殖。在肉汤培养基中生长，浑浊，有菌膜或壁环，振摇易乳化。在一般琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透亮，表面粗糙似毛玻璃状或熔蜡状，边缘常呈扩展状；偶有

2、产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血；在甘露醇卵黄多黏菌素(myp)平板上，呈伊红粉色菌落。 蜡杆芽孢杆菌耐热性较强，其37 16h的肉汤培养物的d80值（在80时使细菌数削减90所需的时光）为10-15min; 50时不生长。其繁殖体不耐热，在100下加热20min可破坏这类菌。游离芽孢能耐受100 30min，而千热120经60min才干杀死。 (3）生化反应特性在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从、不产酸，分解糖类不产气。大多数菌株还原硝酸盐，50时不生长。 1.2致病性 引起食物中毒是因为该菌产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，包括腹泻毒素（dt）与呕吐毒素（vt）两种。dt是该菌

3、在对数生长久合成并释放的胞外毒素，为多组分蛋白质，分子质量为38-40kda，对热不稳定，45处理30min或56处理5 min就可以导致其失活，对链霉蛋白酶与胰酶敏感，但ph小于4或大于11时不稳定，抗原性较强可以产生特异性抗体，主要导致腹泻、腹痛，但不发热。由多组分蛋白质构成；而vt被认为是某些菌株在芽孢形成时产生的小分子多肽，分子质量普通小于5kda，热稳定性好，120处理90min仍很稳定，且对胃酶与胰酶有抗尸性，在ph 2-11范围内稳定，无抗原性，主要症状为恶心、呕吐、偶有腹痛，也不发热。蜡样芽孢杆菌除了产生上述两种肠毒素外，还产生溶血素等细菌毒素。 呕吐型的埋伏期为0.5-6h；

4、中毒症状以恶心、呕吐为主，间或有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24h。腹泻型的埋伏期为6-15h，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24h。 广泛存在于尘埃、土壤、空气、水体、动植物体表，以及各种裸露于空气中的肉制品、乳制品、水果、干果、乳粉、奶油、生菜、炒米饭以及各种甜点等中，而且因为该菌能产生耐热的芽孢，所以当食物被该菌污染而又加热不足时简单导致该菌繁殖，并产生细菌毒素，从而引起摄食者中毒。引起蜡状芽孢杆菌食物中毒的食品大多数无腐败变质现象，除米饭有时微黏、入口不爽或稍带异味外，大多数食品感官正常。 二、常用检验培养基及检测原理 常用蜡样芽孢杆菌的挑选分别培养基为甘露

5、醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（myp）,myp中蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子；d-甘露醇为可发酵糖类；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；酚红为ph指示剂；卵黄含有卵磷脂，蜡样芽孢杆菌产生卵，在菌落周围产生沉淀环；并不发酵d-产酸使菌落显红色；多黏菌素b可抑制杂菌的生长。 三、国家标准蜡样芽孢杆菌检测办法 gb 4789. 14-2014食品平安国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验（第一法）平板计数法。 3.1检验程序 蜡样芽孢杆菌的检验程序4-36所示。 3.2操作步骤 (1)样品的制备取待检样品，用无菌剪刀将样品剪碎，称取样品25g，放入盛有225ml无菌磷酸盐缓冲

6、稀释液（或无菌生理盐水）无菌均质杯中，用旋转刀片式均质仪以18000 - 20000r/min均质12min，或拍击式均质器拍击1-2min。若样品为液态，吸取25ml样品至盛有225ml pbs或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。取1：10稀释液1ml加到含有9ml无菌磷酸盐缓冲液（或无菌生理盐水）的稀释瓶中，充分混匀制成1: 100的稀释液。据对样品污染情况的估量，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml无菌吸管或吸头，普通状况稀释到10-6。 (2）样品接种按照对样品污染情况的估量，挑选2-3个

7、相宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3ml, 0.3ml, 0.4ml接种量分离移入三块myp琼脂平板，然后用无菌l棒涂布囫囵平板，注重不要触及平板边缘。用法前，如myp琼脂平板表面有水珠，可放在25-50的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。 (3）分别、培养在通常状况下，涂布后，将平板静置10min。如样液不易汲取，可将平板放在培养箱30±1培养1h，等样品匀液汲取后翻转平皿，倒置于培养箱，30±1培养24h±2h。假如菌落不典型，可继续培养24h±2h再观看。在myp琼脂平板上，典型菌落为微粉红色（表示不发酵），周围有白色至粉红色沉

8、淀环（表示产卵磷脂酶）。 从符合计数要求每个平板中挑取起码5个典型菌落（小于5个全选），分离划线接种于养分琼脂平板做纯培养，30±1培养24h±2h，举行确证明验。在养分琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透亮，表面粗糙似毛玻璃状或熔蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4-10mm。 (4)确定鉴定 染色镜检：挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，大小为(l-1.3)um×(3-5)um，芽孢呈椭圆形，位于菌体中心或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状罗列。 生化鉴定：挑取纯培养的单个菌落，举行过氧化氢酶实验、动力

9、实验、硝酸盐还原实验、酪蛋白分解实验、耐性实验、vp实验、利用（厌氧）实验、根状生长实验、溶血实验、蛋白质毒素结晶实验。蜡样芽孢杆菌生化特征与其他芽孢杆菌的区分见表4-23。 注：“+”表示90 %-100的菌株阳性；“一”表示90 %-100的菌株阴性；“十一”表示大多数的菌株阳性；“一”表示大多数的菌株阴性。 a动力实验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30培养24h。有动力的蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈蔓延生长，而覃状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。 b溶血实验：挑取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30±1培养24h±2h。蜡样芽孢杆菌菌落为

10、浅灰色，不透亮，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或彻低溶血环。苏云金芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌展现弱的溶血现象，而多数炭疽芽孢杆菌为不溶血，巨大芽孢杆菌为不溶血。 c根状生长实验：挑取单个可疑菌落按间隔2-3cm距离划平行直线于经室温干燥1-2d的养分琼脂平板上，30±10c培养24-48h，不能超过72h。用蜡样芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌标准株作为对比举行同步实验。覃状芽孢杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽孢杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。 d溶菌酶耐性实验：用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36±1培养24h。蜡样芽孢杆菌在本培养基（含0.001溶菌酶）中能生长。如浮现阴性反

11、应，应继续培养24h。巨大芽孢杆菌不生长。 e蛋白质毒素结晶实验：取经30培养24h并于室温放置3-4d的养分琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。以自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气（勿使染液沸腾）后持续1-2min，移去火焰，使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观看有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发觉游离芽孢形成的不丰盛，应将培养物置室温2-3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。 试验结果符合蜡样芽孢杆菌群的形态特征

12、，动力实验阳性，溶血实验阳性，不能形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌阳性。 生化分型（选做项目）：按照对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、vp实验反应、明胶液化实验，将蜡样芽孢杆菌分成不同生化型别，见表4-24。 注：表示90%-100的菌株阳性；一表示90一100的菌株阴性。 (5）结果计算典型菌落计数、确认和计算公式参照本章4.6.3.1金黄色葡萄球菌的baird-parker平板计数（其次法），其中a表示某一稀释度蜡样芽孢杆菌典型菌落的总数；b, b1 ,b2表示鉴定结果为蜡样芽孢杆菌的菌落数；c,c1,c2表示用于蜡样芽孢杆菌鉴定的菌落数。 (6)结果与报告按照myp平板上蜡样芽孢杆菌的典型菌落数，按公式计算、报告每克（每毫升）样品中蜡样芽孢杆菌菌数，以cfu/g (cfu/ml）表示；如t值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。须要时报告蜡样芽孢杆菌生化分型结果。 四、fda/bam蜡样芽孢杆菌检测 蜡样芽孢杆菌检验程序4-37所示。 蜡样芽孢杆菌的分别物应符合下述条件：革兰氏阳性产芽孢大杆菌，其芽孢不突出体外；在myp琼脂上产生卵磷脂酶