华南师范大学实验报告

1、本文格式为word版，下载可任意编辑华南师范大学实验报告 华 南 师 范 大 学 实 验 报 告 同学姓名 李思颖 学 号 专 业 综合理科二班 班级、班级 07 级 课程名称 生物化学试验 试验项目 folin-酚法测定血清蛋白的含量 试验类型 验证 设计 综合 试验时间 2021 年 10 月 6 日 试验指导老师 陈老师 试验评分 一、目的 1、学习分光光度计的原理和使用方法。 2、学习 folin酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 3、进一步把握比色法或分光光度法，精确测定未知样品。 二、原理 蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外汲取测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩

2、脲反应，folin酚法是一般试验室中常常使用的方法。folin酚法是双缩脲法的进展，反应的第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸磷钨酸试剂（folin 氏剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。 优点：folin酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏 100 倍。 缺点：所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约 0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必需做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液即可显色测定。

3、若样品酸度较高，显色后色浅。则必需提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 血清：使用前稀释 100% （二）试剂 1、标准酪蛋白溶液：称取 125 毫克酪蛋白粉末，用 0.1n 氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到 250 毫升，则配成 500 微克/毫升的标准酪蛋白溶液。 2、folin酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。 （1）4%碳酸钠溶液 （2）0.2n 氢氧化钠溶液 （3）1%硫酸铜（cuso 4 5h 2 o）溶液 （4）2%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1）和（2）等体积混合成碳酸钠氢氧化钠溶液。将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜酒石酸钾钠溶液。然后将

4、这两种溶液按 50：1 的比例混合，即为 folin酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 3folin酚试剂乙：在 2 升的磨口回流装置内加入钨酸钠（na 2 wo 4 2h 2 o）100 克，钼酸钠（na 2 moo 4 2h 2 o）25 克，蒸馏水 700 毫升，85%磷酸 50 毫升和浓盐酸 100 毫升，充分沸合后以小火回流 10 小时，再加入硫酸锂（li 2 so 4 ）150 克，蒸馏水 50 毫升及数滴液体溴。然后开口连续沸腾 15 分钟，以驱除过量的溴。冷却后定容到 1000 毫升，过滤，溶液呈绿色。 用 folin酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液（1n 左右）以标定 fol

5、in酚试剂乙的浓度。以酚酞为指示剂。当溶液的颜色由红色变为紫红色、紫灰，再突然转变为墨绿时，即为终点。该试剂酸度一般为 2n 左右，此为贮存液。也可以用氢氧化钠去滴定 folin酚试剂乙，但终点较不易把握，此时溶液颜色由浅黄变为浅绿，再变为灰紫为终点。 使用前应予以适当稀释，使其成为 1n 的酸，此为 folin酚试剂乙使用液。 以上两液均应装于棕色瓶内，贮于冰箱中，可以长期保存。 （三）器具 1、试管及试管架 2、吸量管（1，5 毫升） 3、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）标准曲线的制作 取 12 支试管，分别加入 0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 毫升标准酪蛋白

6、溶液（500 微克/毫升）用水补足到 1.0 毫升，以上每种浓度各做一份重复，即平行做两份，按挨次向各管加入 3 毫升 folin酚试剂甲，混匀，室温下放置 10 分钟，再依次向各管加入 0.3 毫升 folin酚试剂乙，马上摇匀，在室温下放置 30 分钟，然后于 500nm 处比色。看两个平行管的光密度值是否接近，取其平均值，以光密度（0.d）为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。 此次试验时室温是：28 （1）第一组试管 试管号 标准酪蛋白溶液（ml） 蒸馏水（ml） folin-酚试剂甲（ml） folin-酚试剂乙（ml） 光密度（a） 1 0 1.0 3 0.3

7、0.037 2 0.2 0.8 3 0.3 0.163 3 0.4 0.6 3 0.3 0.197 4 0.6 0.4 3 0.3 0.336 5 0.8 0.2 3 0.3 0.392 6 1.0 0 3 0.3 0.465 (2)其次组试管 试管号 标准酪蛋白溶液（ml） 蒸馏水（ml） folin-酚试剂甲（ml） folin-酚试剂乙（ml） 光密度 1 0 1.0 3 0.3 0.028 2 0.2 0.8 3 0.3 0.123 3 0.4 0.6 3 0.3 0.265 4 0.6 0.4 3 0.3 0.316 5 0.8 0.2 3 0.3 0.395 6 1.0 0 3 0

8、.3 0.453 （3） 试管号 1 和 1 2 和 2 3 和 3 4 和 4 5 和 5 6 和 6 酪蛋白溶液浓度(ug/ml) 0 100 200 300 400 500 平均光密度 0.033 0.143 0.231 0.326 0.394 0.459 （4）酪蛋白的标准曲线 y = 0.0009x + 0.0516r 2 = 0.990900.10.20.30.40.50.60 200 400 600系列1线性 (系列1) 现象分析： 两组试管分别加入 3mlfolin-酚试剂甲后，试管 1 和 1仍显示无色透亮，但从试管 2 至6、试管 2至 6均消失淡紫红色，并随试管序号递增依

9、次加深（每支试管必需与试管 1 或 1在白色背景下才能看出淡紫红色）。由于 folin-酚试剂甲试剂有碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸甲钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物，而各支试管的蛋白质浓度均不大，所以紫红色特别浅。 两组试管分别加入 3mlfolin-酚试剂乙后，均呈现蓝色，而且随着试管序号的递增蓝色依次加深，呈现肯定的梯度。由于乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中的酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量呈正比。 （二）血清样品的测定 取 2 支试管，各加入肯定量血清稀释液（应使其蛋白质含量在酪

10、蛋白标准曲线范围之内）本试验取 0.4 毫升血清稀释液，再加 0.6 毫升蒸馏水使样品体积达到 1 毫升。其他操作与"标准曲线的制作'相同。 试管号 血清稀释液(ml) 蒸 馏 水（ml） folin-酚试剂甲（ml） folin-酚试剂乙（ml） 光密度 平 均 光 密度 1 0.4 0.6 3 0.3 0.154 0.154 2 0.4 0.6 3 0.3 0.133 3 0.4 0.6 3 0.3 0.154 现象分析： 试管 1 至 3 的血清浓度理论上是全都的，试管 1 和试管 2 测得的 a 值全都，不过试管 2测得的 a 值与其它两支管的值相差较大，缘由可能是加

11、入 2 号试管的血清过少或蒸馏水的量过多，导致 2 号试管血清浓度比 1 号和 3 号试管小，最终使 a 值偏少。因此 2 号试管的值不采纳。 （三）计算 将血清样品的光密度读数在标准曲线上查出相应标准酪蛋白溶液的浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清蛋白质的微克数，最终准备成临床化验上通用的单位克%，即 100 毫升血清中含蛋白质的克数。 把血清的平均光密度值 0.154 代入标准方程 y=0.00009x+0.516 中的 y 即可得 x 值为 114，再把 114 代入以下方程 62.5 100( /100 ) 10010ml´

12、´= ´标准曲线查得值血清蛋白含量 克 则试验的血清蛋白含量为：0.0285（克/100ml） 五、争论 1、分光光度计的结构 分光光度计是一种靠光栅或棱镜供应单色光的，简单、精致的仪器。它不仅能在可见 光区测定有色物质的汲取光谱，而且也能在紫外光区和红外光区测定无色物质的汲取光 谱。分光光度计的种类许多，其原理和结构基本相像，一般都包括以下几个部件： （1）光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯（或氘灯）。在可见光区， 近紫外光区和近红外光区常用钨灯；在紫外光区，多使用氢灯（或氘灯）。 （2）单色器 它是把混合光分解为单一波长光的装置。多用棱镜或光栅作为它的色

13、散元件。光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，波长愈短，折射率则愈大，反之，波 长愈长，折射率则愈小，因而能将不同波长的光分开。 （3）汲取池（比色皿、比色池）一般由玻璃、石英和熔凝石英制成，用来盛被测试的 溶液。 （4）检测器 由光电池、光电管、光电倍增管组成。 （5）测量装置 以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的仪 器常附有自动记录器，可自动描出记录曲线。 2、比色皿的使用和清洗 分光光度计比色皿类型多样，但最常用的是光径 1cm 方形杯。由于 330nm 以下的光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。同组使用的比色皿必需配套，以装有纯溶剂的比色皿，在试

14、验波长下，测定光汲取是否全都而进行选择、搭配。 比色皿四周仅有两面系光滑透亮，具有光学性质，另两面则无，它们常以磨玻璃为材 料，以示区分。比色皿光学表面不能有任何污损，否则会引起光汲取的增加。 比色皿中所盛溶液不能太少，否则光路不能透过待测溶液；但也不能太多，否则溶液 易洒出，从而污损或腐蚀仪器，一般所盛液体约占全部容积的 2/3。每次使用后，应马上倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色杯 3-4 次。比色皿的外表面应以高质量的松软擦镜纸擦洁净，不能使用易磨损比色皿的一般纱布。 3、加入 folin酚试剂时的留意事项 folin酚法所用的试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应，试剂乙（磷钼酸和磷钨酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被铜蛋白质复合物还原成钼蓝和钨蓝。因此，在进行测定时加 folin酚试剂要特殊当心，由于 folin酚试剂乙仅在酸性 ph 条件下稳定，但上还原反应只是在 ph10 的条件下发生，故当 folin酚试剂乙加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必需马上混匀。以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前，（还原反应即能发生）能有效地被 cu 2+ 蛋白质结合物所还原。 4、其它侧蛋白质浓度的方法 总氮量的测定、双缩脲法、紫外线法、染色法。 六、小结 1、在对两组试管分别加进 folin-酚试剂甲后只是每支拿起来直