技术专辑之五

1、RNAi技术专辑之五在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的 RNAi现象，实验表明通过目的基因序列的 双链RNA可以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的dsRNA最简单的方法就是体外转录合成双向的RNA如果研究对象不是哺乳动物细胞，那要开展RNAi的实验就要简单很多。因为可以采用较长的双链 RNA诱导RNAi现象，而无需制备 特定的siRNA。在这里生物通将介绍几个制备长链 dsRNA勺试剂盒。（值得注意 的是在哺乳动物细胞内，大于 29nt的双链RNA引发的是非特异基因沉默，21nt 大小的双链RNA也就是我们前面所说的siRNA能有效引发特异的基因沉默。由 于体外转录很难合成25nt以

2、下的短链RNA生物通在前面为大家介绍了一些利 用试剂盒或者质粒合成siRNA的产品。参考相关文章）MEGAscript? RNAi Kit合成大量纯净的双链RNA是 RNAi实验成功的关键。这个基于专利的转录 高产技术的产品正是为大量合成用于 RNAi实验的dsRNA而优化的。试剂盒要求 用两端带有T7启动子序列的目的基因作为模板（200nt以上，模板可以是质粒 载体上的，也可以是用带有T7序列的引物扩增的PCF产物，另外也可以选用一 个叫Lig ' n Scribe Kit可以将T7 Prometor序列直接连接到 DNA片断的两端）， 将模板和试剂盒提供的dNTP酶等混合，根据模板

3、的长短进行体外转录反应。 每次反应可以合成50ug 100ug甚至更多的dsRNA（800nt以上的需要先加热变性 并褪火形成双链 ），产量是常规的 1050倍，整个试剂盒总产量可达 2mg（20 次反应，每次100ug）。合成的产物经过DNaseI消化去除DNA模板，再经过特 殊的单链RNase （试剂盒里提供，后文介绍）除去单链的RNA最后经过柱纯化就得到纯的双链RNA即可用于RNAi实验。由于这个试剂盒提供全套产品，使 用相当方便。T7 Pramater17 PromoterdANA ready for RNAl10 10U1A0O10 10Plnell AnMdsRNAhrp4G1!1

4、AFS®Pah I hrp4BU2AFS0G I S Ifr rM hrp4& dRNAPaflCl B.Silencing of Drosophila hrp48 and U2AF Protein by dsRNA.A. Specific Reduct ion of Expressi on Levels.1 x 10 6 Schneider' s Drosophila melanogaster L2 cells were grown in 6-well plates in serum-free medium and treated with 10 nM of dsR

5、NA specific for either50hrp48 or U2AF . dsRNA were prepared withthe MEGAscript RNAi Kit and post-tra nscripti on ally labeled with Cy3 using the Silencer siRNA Labeling Kit when in dicated (+). Cells were harvested 72 hours post treatme nt and the sile ncing effect was an alyzed by Wester n blot wit

6、h anti-hrp48 (48 kDa, migrates as a doublet)50and an ti-U2AF(50 kDa) an tibodies. Anan tibody directed aga inst Pab 1 (lower pan el) was used as a sec ond n egativeTranscrbe with17 RNA PolymerasedANA ssRNA DNAlbnlarttDNase/RNaseCleanup control. B. Dose-sensitive Reduction of Protein Expression Level

7、s. dsRNA-triggered silencing of hrp48 was analyzed as in Figure 2a using the indicated concentrations of hrp48 dsRNA made with the MEGAscript RNAi Kit. Western analysis was also performed with the50anti-U2AF (bottom panel) and Pab 1 (data not shown) antibodies as negative controls.HiScribe? RNAi Tra

8、nscription KitRNA 干涉( RNAinterference) 是近年产生的研究转录后剪切的一种实验方法。它将目的基因所对应的双链 RNA导入生物体，导致相应的 mRN降解。和 反义技术不同的是，在基因表达恢复之前，RNA干涉现象将持续多个细胞分裂周 期，因而它是一种有力的研究基因功能的工具。它不是传统的在DNA水平基因敲除，而是通过RNA干涉，在RNA水平上去除目的RNA这样大量基因功能可以 快速经济地进行检测。HiScribe? RNAi Transcription Kit 也是一个体外合成双链 RNA进行 RNA干涉实验的试剂盒。 不同于前者的是， 这个试剂盒提供质粒作为载

9、体， 方便了以 后的扩增和复制。LITMUS?载体多克隆位点两端带T7启动子。目的序列插入多克隆位点，利用T7 RNA聚合酶同时转录DNA摸板的双链，合成双链 RNA载体启动子为T7野生型序列，是已知最强的启动子之一，以保证转录产率的最大化。 带有插入 lacZ a 片段供蓝白筛选。该试剂盒也可合成单链RNA在RNA吉构研究，核酶化学，体外翻译，RNA蛋白相互作用，反义技术等方面有广泛应用。该试剂盒包含LITMUS双向转录克隆载体，适用体外如显微注射、细胞转染和体内RNA干涉在内的所有转录实 验。该试剂盒包括足够的试剂可在 2ml的反应体系中合成多至2mg的双链RNA 包括：LITMUS 28

10、i 克隆载体，LITMUS 38i 克隆载体(LITMUS 28i 和 38i 二者只是多克隆位点有所不同)，对照载体，T7引物(19-mer),5' -dTAATACGACTCACTATAGGOX 含 NTP的缓冲液，T7 RNA聚合酶，上样缓 冲液和电泳 Marker 2-Log DNA Ladder (100- 10,000 bp)等等。价格也相当，3750人民币。但是可惜的是试剂盒没有提供消化DNA模版和单链RNA的酶以及纯化的工具，需要另外购置。单独购买的相关产品生物通将在后文继续介绍。更多关于RNAi产品介绍请继续关注生物通技术前沿专栏。T arget Sequen ceL

11、inearized Plasmi dPGR ProductTemplatesdsRNA, 0 5-1 mg/mlFigure 1:用带插入子的 LITMUS 28i合成双链RNAp各g DN A P/S Ladder8000 bp1000 bp500 bpFigure 2:用 HiScribe RNAi Transcription Kit体外合成单链和双链 RNALITMUS 38i含1.3 kb荧光酶片段，分别用 PspOM I (P)和Stu I (S) 剪切。产 生的线形摸板再分别(P和S )或一起转录(P/S)，产生单链和双链RNA琼脂 糖电泳1 d反应液至少含0.5旧RNA在细胞内表

12、达siRNA引发基因沉默RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的 功能，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(smallinterfering RNAs)，或者是 45 50-mer 的发夹结构 RNA( small hairpin RNA, shRNA转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉 默或者表达抑制。现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。尽管细节各有不同，但载体大都是用PolIII启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用PolIII启动子的

13、原因在于这个启动子 总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA遇到4 5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有 PolIII启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺 乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的 选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备 siRNA 的成本。因为质粒的价钱大约是 3000多人民币，还不到化学合成1条21nt的 RNA介格的一半，但是就可以自行制备 siRNA

14、而不受数量的限制。生物通在这里 为大家介绍几种不同的siRNA合成质粒，但是大家要注意的是这里介绍的siRNA 质粒是不同于体外转录合成 RNA勺质粒（生物通在后文会继续为大家介绍），因 为这里制备的是用于哺乳动物细胞实验的 siRNA,而不是长链的RNA（长链的 dsRNA不适宜用在哺乳动物细胞，因为会引发非特异抑制，参考RNAi-回顾）pSilencer siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达 siRNA的一系列载体。在载体上包含有 RNA聚和酶III （Pol III ）启动子，氨 苄抗性基因和大肠杆菌复制子， 只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、 其 RNA能形成

15、发夹结构（就是回文结构）的 DNA序列插入载体中Pol III启动子的 下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的RNA这种RNA艮快在细胞中加工成为 siRNA。这些表达载体已经成功的在 Hela 细胞中抑制了包括 Cyclophilin 、 GAP D、H p53、c-myc 在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体 外合成的siRNAs抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的siRNAs抑制。pSilence 1.0-U6载体 pSilence 1.0-U6 是采用小鼠 U6 Pol III 启动子。这个由哈佛大 学开发的载体已经成功的在 Hela、H1299, U

16、-2 OS和C-33A细胞中敲除了 cdk-2 和 laminA/C 的表达。这个载体经过 Apa I 和 EcoRI 酶切线性化和纯化，你只需 要合成一对 55-mer 的寡核苷酸，带有 4 个碱基的突出（当然是对应 ApaI 和 EcoR I 酶切位点咯） ，一起退火、 快速连接就可以转化了。 在购买线性化的质粒同时， 厂家还提供带有GAPDHiRNA的环形质粒对照（万一线性质粒不够用还可以自己 扩增再切嘛！）pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1这两个载体带有不同的 RNAPol III 启动子， pSilencer 2.0-U6 带的是人的U6启动子

17、，pSilencer 3.0-H1则是用H1 RNAB动子（RNaseP的一个组成部分）。这两个载体都是用BamH 和 Hi nd III线性化并且经过纯化的，方便定向克隆。这两个载体都是以线性化的质粒供应,同时还提供GAPD对照和一个空白对照质粒，以及DNA退火的BufferBamHISense StrandLoopiiirRNA Fol IIIAntisense Strand Terminateir1Hind III15' GATCCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCAAGAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTGGAAAy3' GGNNNN训N

18、NfW界削NNNNNAAGTTCTCT粗碉那NNNNNNNNNNNWNAAAAAAUCTTTTCGA 5'-U6阿如pSifenc«r L0-U6i：3.2kblp Silencer 2.0-U6 11 kb)i襄禱衞Panel A.Panel b.L- I J I w 1pSilencer ? siRNA Expression Vectors; Maps and siRNA DesignFor each target gene two compleme ntary 55-60 mer oligo nucleotidesmust be prepared. Theoligo n

19、ucleotides should en code the 19 mer hairp inseque nces specific to the mRNAarget,a loop seque nee separat ing the two compleme ntary doma ins, and a polythymid ine tract to termin ate tran scripti on by RNA Pol III. The insert desig n show n above is specific forthe pSilencer 2.0-U6 and 3.0- H1 Exp

20、ression Vectors and contains the overhanging 5' ends to facilitate efficient and directional cloning into these plasmids. The insert forpSile ncer 1.0-U6 would contain the appropriate end seque nces for cloning into theApaI and EcoR I sites. Early indicationssuggest that a great deal of latitude

21、 is availablein the design of the loop; here we provide our default loop sequenee that we find works well.Not)-trdn$fe<tdNotttf0n $1"；汐:严2：入4八- .% . * pUSer 1.0 U6 GAPDHplencer 1.0-UC &APDHGAPDH Reduction120-100-80 -6040200丄BA.15pj/kncer I.0-U6 GAPDH100I SAMPLECELL «SIGNALCEU/ SIGNALRJLATTVEEXPRESSION 1NoMran$fected307185361048.76038100pSrfeocerw l.OWGAPOH242222166 4-8.091815C.pSile ncer -In duced Reduct ions in Target Gene Expressi onpSilencer 2.0-U6 and 3.0-H1 vectors encoding hairpin siRNAs specific to GAPDH, cyclophili n, or a non-geno mic seque nee