基因的克隆、表达载体构建及功能验证

1、基因的克隆、表达载体构建及功能验证(一般性方法)一、 基因克隆 事前三问a. 克隆这个基因干什么？它有什么功能？b. 这个基因在哪种材料中扩增？c. 材料需要怎么处理？ 实验前准备工作a. 设计引物，准备材料，b. 购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c. 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素准备 基本流程提取和纯化 RNA cDNA第一条链合成 一PCR凝胶电泳一胶回收一连接一转化一 涂平板 挑单菌落 摇菌提质粒 测序1. 总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol 是一种高效

2、的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解 植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于 下一步的实验。1) 实验前准备预先配制0.1%的DEP( ddH2O中含0.1%DEPC V/V, 37 C过夜处理12 h ),高温 灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需 200 C灭菌至少4 h，所用枪头 和枪盒均去 RNA酶处理(直接购买)。2) Trizol 法(小麦)叶片或根的总RNA实验步骤如下：(1) 提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol ，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末， 移入管内，用力摇15 s，在15

3、-30C温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。(2) 4C , 12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、 高 分子量 DNA， 上清 中 含有 RNA。(3) 吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇 15 s , 1530 C温育23 min。(4 )在三12000g, 4C离心10 min,样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无 色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。(5) 将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA室温静止30 min 。(6) 在三12000g , 4C离

4、心10 min，离心前看不出 RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶 状沉淀。(7) 用1 ml的75%乙醇洗RNA涡旋振荡样品，在w 7500g, 4C离心5 min，弃上清。(8) 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100卩I用枪头吸几次，5560 C温育10 min使RNA溶解。( 9 )配制以下体系：10X DNase buffer5 MlDNase I ( RNase-free )( 40 M g/ M l )1MlRNasin Inhibitor( 40M g/ M l )1MlTotal RNA70Mg加去RNase水至总体积为50 M l(1

5、0) 37 C水浴1h,加DEPC处理的水至总体积为100 M l ,加入等体积氯仿抽提一次。(11) 取上清，加入10卩I的3 mol/L NaAC溶液，200卩I的无水乙醇，-80 C沉淀30 min。(12) 28 C, 12000g离心10 min，弃清液，干燥后取 50卩l无RNase的水溶解 RNA3) RNA的质量及纯度检测(1 )电泳检测 取2ul RNA与1 ul 10X Loading buffer上样缓冲液混合均匀在 1%的 琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯下观察 RNA 条带并记录实验结果。(2)分光光度计RNA纯度检测取1ul RNA液，以DEPCK为空白对照，测定 A26

6、0/ A280比值，估测 RNA质量。4) cDNA第一条链的合成按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA1) 在Eppendorf管中配制下列混合液：试剂名称使用量模板RNA1Oligo dT primer (50(JM)1山dNTP Mixture(10 mM)1MRNase free dH2Oup to 10M2) 65 C保温15 min后迅速在冰上急冷 2 min。3) 离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集 Eppendorf管底部。4) 在上述 Eppendorf 管中配制下列反转录反应液 :使用量试剂名称上述模板RNA/引物等的混合液10 M5X Frist -St

7、and Buffer4MlRNase Inhibitor(40U/ Ml)0.5MlMTV RTase (10 U/Ml)0.5MlRNase free dH2Oup to 205) 37 C保温 60 min。6) 95 C,5 min后冰上冷却，得到的 cDNA溶液用于PCR扩增。1.2小麦胚及胚乳总 RNA的提取1)1M Tris-HClPH 9.0)2.5ml4MNaCl1.5ml10%SDSmlDEPC-H2O41.25ml2)取以上RNA提取液650 ul ,加 350 ul 水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 C水浴预热。3)研磨 0.3 g 材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚

8、挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，配制 RNA抽提buffer ，50 ml中含有:立即剧烈震荡，约 10 min 。5)6)7)再加入 400ul 氯仿，抽提 10 min，取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇取上清，加 1/3 体积的 8 M 氯化锂，离心10 min，弃上清液，留沉淀，用12000rpm 4C离心 10 min。10 min , 12000rpm 4 C离心 10 min 。4 C保存过夜。75%乙醇洗 1 次，再用无水乙醇洗5-10 s ，晾干，溶于 80 ul DEPC 水中。(8)加入 9 ul DNA酶(无 RNA酶),10 ul 10x buffer ( DNA酶

9、所带)和 1ulRasin ( Rnas抑制剂)， 37 C 30 分钟(再加 500 ul水)9)取出用 300 ul 氯仿和 300 ul 苯酚抽提，摇 10 min 钟，静止 10 min，12000 rpm 4 C离心 10 min 。(10) 取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min , 4 C离心10 min。(11) 取上清，加1/10 NaAC (3M PH 5.2 )，再加2倍体积的预冷无水乙醇，-80 C冰 箱过夜；(10) 12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80 C,备用。2

10、.2.2.1 cDNA 第一条链的合成(1)基因组DNA的去除反应试剂使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ulTotal RNAgDNA Eraser1.0 ul5 ulRNase Free dH 2Oup to 10.0 ul（2）反转录反应试剂42 C 2 min4 C 10 min使用量5xPrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0 ulPrimeScript Rt Enzyme MixI1.0 ulRT Prime Mix1.0 ul的反应液10.0 ulRNase Free dH 2Oup to 20.0 ul37C 15 min

11、85C 5 secC 10 min-20C保存备用2. 基因 cDNA克隆2.1基因片段的PCRT增以反转录后的cDNA为模板进行PCRT增。PCR反应体系为20ul : 10X PCRBuffer 2.0 ul ,2.5 mMdNTPs1.6 ul , 10 mM上下游引物各 0.8 ul , Taq 酶 0.3 ul，模板 CDNA1.0 ul , ddH2O 补足至20 ul o按照下列条件进行PCR扩增：94C4min94C30sec50C40sec30 cycles72C1min72C10 min2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化PCRT增产物在1%琼脂糖凝胶（含有0.5 ug/

12、ml溴化乙锭）上进行电泳，在紫外灯照射 下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1）在紫外灯下切下将要回收的条带（尽量使用长波长的 UV）,称重。2）按每100 mg琼脂糖胶加入 300 ul溶胶液PN置于50 C水浴中10 min，每隔2 min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。3）将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入 600 ul平衡液 BL, 13000rpm，离心30 sec。3）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10

13、柱中，静止2-3 min , 13000rpm，离心 30 sec。4）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW使用前先检查是否已加入无水乙醇），13000rpm离心30 sec。5）取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入 500 ul 漂洗液 PW，13000 rpm 离心 30 sec ，重复一次。6）取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中 ，13000rpm，离心2 min。7）将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70 C洗脱液EB,室温放置5 min。8）1

14、2000 rpm，离心I min , Ep管中液体即为回收的 DNA片段，-20C保存备用。2.3回收产物与PMD-T载体的连接与转化采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。具体操作步骤如下：Solutionl 、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。在 0.2ml 离心管中配制反应体系 10ul ：PMD18-T 载体0.5 ulSolutionI5 ul回收DNA产物4.5 ul混匀，16 C反应过夜（3h就可以）。连接反应快结束时，从-80 C冰箱中取出 DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融化。1）取 5 ul 的连

15、接产物加到 50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴 30 min。2） 将离心管置于 42 C水浴90 s，间不要摇动离心管。取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min ,其丿、3） 向离心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液体培养基，150r/min , 37C震荡培养60 min 。4） 吸取150 ul已摇好的菌液涂布在含有Amp（终浓度50 ug/ml）的LB固体培养基上，待液体完全被培养基吸收后，倒置平板，37C，培养12-14小时。2.4 重组克隆的验证及序列测定随机挑选5个左右单菌落于10 ml含50 ug/ml的LB液体培养基中，于恒温摇床37 °,18

16、0r/min震荡培养过夜，培养至菌液0臥为0.60.8，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。 也可按照下列步骤提取质粒：1）将培养好的菌液倒入 2.0 ml离心管中，12000rpm离心1min ,去掉上清液，再重复二次。2） 加入100 ul预冷的溶液 P1涡旋使充分悬浮，室温静止5 min。3）加入200 ul溶液P2,同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5 min。4）加入150 ul溶液P3,同一方向缓慢匀速转动离心管使内含物在溶液中分散均匀，置冰上 5 min 。5） 12000 rpm,离心10 min，取上清，用等体积的苯酚和氯仿：异戊醇（24:l），各抽提一次。6）12

17、000 rpm，离心 3 min，取上清。7） 向上清中加入 2倍体积的无水乙醇，混匀，-20 C,放置30 min , 12000 rpm,离心10 min。8） 弃上清，加入I ml75%乙醇，洗涤沉淀，12000 rpm离心3 min，弃上清，自然晾干。9）每管中加入 30 ul TE （pH 8.0） buffer 和 1 RNase（10ug/ul ） , 37C水浴 30 min 溶解 质粒DNA,-20C贮存备用。溶液的配制：Solutionl:葡萄糖 50 mM; EDTA(PH8.0) 10 mM;Tris-Hcl 25 mMSolutionll:NaOH 0.2 M;SDS

18、 1%（现用现配）SolutionHI:乙酸钾 60 mM;冰乙酸 11.5 ml;ddH2O 28.5 ml采用上文中的P1、P2特异性引物以质粒为模板进行PCRT增，扩增结果与RT-PCR相同的质粒为验证的阳性质粒，由华大基因工程有限公司进行序列测定。植物转化表达载体的构建事前三问a. 构建什么载体（过表达，干扰？还是别的）？酶切位点有哪些是可以用的？怎么 用方便？b. 载体的细菌抗性和筛选抗性分别是什么？c. 准备转到哪种材料里？用什么方法转？实验前准备工作a. 选择一个合适的表达载体b. 酶切位点选择：用 DNAMAN 中的Restriction-Restriction Analysi

19、s分析待插入基因中包含的酶切位点，避免使用基因中已有的酶切位点。剩下的酶切位点的选择 依据的原则为：方便（酶反应温度、Buffer 一样，可以双酶切）、快捷（可以省时酶切）、便宜。c. 设计带酶切位点的引物d. 购置试剂：高保真酶或 LA Taq酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒等e. 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素探基本流程a. 过表达载体CDNA跑脈、回收一连按、转化l 提廣粒一测序以质粒为撲板用带 酚切位点弓物PCR提质粒CD测序回收 的片段空载休*酶切*跑胶保存质粒 待转化愈伤* 组织请测序公司设计表达戟诽特异性引物测序提质

20、粒*冋收:载体大片连接、转化测序碉定后质粒即为构.建好的表达载体Ncol 和酶切#:如果两个酶可以同时酶切，就直接双酶切；如果不能，按以下方法进行以BstEII为例和：1）取一灭菌的200ul的离心管按顺序依次加入：10X Buffer 2 ulNcol 1 ulPlasmid 2-3 ulddfO补足 20 ul2）混匀，37C水浴3 h，再向管中加入 2倍体积的无水乙醇，4C放置 1 h, 12000 rpm离心10 min , 75%的酒精洗涤一次，晾干，再向离心管中分别加入：10X Buffer 2 ulBstEII1 ulddfO17 ul3）混匀，60 C水浴3h后用1.2 %的琼

21、脂糖凝胶电泳检测，将所需要的目的片段在紫外光下 切下来，用琼脂糖DN/回收凝胶剂盒回收纯化小片段。同时用同样的方法酶切表达载体（如 PCAMBIA3301 ,回收大片段。CDNA一 PCR-；K，回收以錠它为嘆股分呈 弔於聲询位点乳b和J对引物A和D分别PGRb. RNA干扰载体的构建捲莫乜A和D 一爵切# 一跑较_片以回*距已、b酶叨 *却胶回收载津大片段二-/1st切世测确定粒 连接、转乡舟请目序公 司没计表达* 载乞芍异性 引杓卫冬取s d尊一跑胶-f回收载津大片段彳 尊切确定质粒富连發、爰化测序菠定百廩粒即为构建好的表达载士三、功能验证目前本实验基因的功能验证主要采取转基因的方法，常用

22、的转基因方法有基因枪转化 法和农杆菌介导法。目前实验室做的是农杆菌介导法转化水稻。下面把两种方法都介绍一下:实验前准备工作34,转化水a.准备好诱导愈伤的材料（我们用农杆菌介导法转化小麦茎尖用豫麦 稻愈伤用kitake ;用基因枪法一般用豫麦 18）。 b准备好配制各种组培培养基的试剂和药品。c. 准备好光照恒温培养箱。探基本流程（农杆菌介导法转化水稻）种子消毒 诱导愈伤（30d左右）共培培养（3d）恢复培养（7d）农杆菌转化重组载体一 筛选培养（30d以上）分化培养（90d左右）移栽到花盆至成熟§农杆菌介导法转化水稻1.农杆菌感受态细胞的制备转化1）取出-80 C保存的含农杆菌菌株

23、EHA105的菌液冰上解冻，划线接菌于YEB固体培养基（含Rif 50 mg/L ）中，28 C恒温培养 2天。2）挑取农杆菌EHA105单克隆，接种于10 ml YEB液体培养基（含 Rif 50 mg/L ）中，于恒 温摇床中28 C、200rpm/min培养1-2天。3）在250 ml的三角瓶中加入 50 mIYEP液体培养基及上述过夜培养物的菌液2 ml, 200 rpm/min, 28C培养至 ODb。为 0.5-1。4）冰浴冷却菌液，4000rpm, 4C, 5-10 min 离心收集菌体。5）去上清，沉淀悬浮于1 ml预冷的0.15 mol/L CaCL中，使细胞充分悬浮，分装成

24、100卩l/ 管，每管中加入100 ul预冷的50%甘油，液氮中速冻后至-80 C保存。6）每管加入约1卩g构建好的质粒DNA混匀冰上放置30 min。7）液氮中速冻1 min。8）迅速置于37 C水浴锅中，水浴 5 min。9） 加600 ul YEP液体培养基，28 C, 50rpm慢摇2-4 h，使抗性基因得到表达。10） 于超净工作台上将菌液涂布于YEP固体培养基（含 Rif 50 mg/L , Kan 50mg/L ）,同时设 置一个仅含抗生素的平板做对照。11）于28 C恒温培养箱中2-3 d后检测其生长情况。12）挑取单菌落进行培养提取质粒，并且进行酶切鉴定。附：YEB培养基的制

25、备YEP夜体（500ml）YEP固体（500ml）YEAST EXTRACT5.0g5.0gTPYPTONE5.0g5.0gBEEF EXTRACT2.5g2.5gAGAR POWDER0.0g1.5g/100ml灭菌：121C, 20min2 水稻基本培养基的配制单位：mg/L表2-1水稻基本培养基的配制成份N6-P mediumN6-AS mediumN6-R mediumMS-F mediumN6 salt mixture3,9813,9813,981/MSsalt mixture/1,000C0CI2 H2O0.0250.0250.025/CuSO45H2O0.0250.0250.02

26、5/NaMoO4 2 H2O0.250.250.25/Glycine2222Myo-inositol100100100100Thiamine HCI5555Pyridoxine1111Nicotinic1111Proline2,800/Casamino acid3001,0001,000/Sucrose30,00030,00025,00015,0002,4-D22/Sorbitol/25,000/Kinetin/2/NAA/0.05/Gelrite4,0004,0008,0002,500pH5.65.65.65.6Table 2-1 Preparing the minimal medium o

27、f rice3. 根癌农杆菌介导水稻转化3.1种子消毒和愈伤组织的诱导1） 选取成熟饱满健康的水稻种子去壳后，75%的乙醇消毒1 min，无菌水漂洗3次，用20%的 次氯酸钠溶液消毒20 min，无菌水漂洗5次。2） 将种子种胚朝下放置到N6-P固体基本培养基上，28 C,光照（12h） /黑暗（12 h），冷 光条件下培养30天左右。3.2农杆菌介导水稻转化以农杆菌菌株EHA105为介导，分别将构建好的表达载体导入受体材料Kitaake,并获得相应的转基因植株。 水稻成熟胚遗传转化的基本流程为：1） 28 C培养以上含重组质粒的农杆菌 16 h，收集菌体，并稀释到含有 100卩mol/L A

28、S的N6 液体培养基中至浓度为 ODb。0.5 ;2） 将适量培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30 min ，滤纸吸干 菌液后转入共培养培养基中， 24 C共培养3 d ;3 ）将上述愈伤接种在含有 3 mg/L Bialaphos （或潮霉素）的N6固体筛选培养基上第一次筛 选16 d；4） 挑取健康愈伤转入 5 mg/L bialaphos 的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每 15 d继代一 次；5）挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化培养；6）待分化成苗的再生水稻植株长至 20 cm高时（约90 d）开口炼苗3 d，并移栽至温室栽培。4 转基因植株的初步鉴定4.1

29、转基因水稻DNA的提取按上述方法用CTAB法提取转基因水稻株系总 DNA并按顺序记号编号4.2转基因植株的 PCR检测以提取的DNA为模板，用引物 P1、P2进行PCR检测，同时用提取的重组质粒做阳性对 照，以水和未转化的水稻 kitaake 为阴性对照，在 1.0%琼脂糖凝胶电泳上检测目的条带是 否存在，以确定转基因的个体。5 外援目的基因的表达分析为了检测外源性目的基因是否在转基因植株中转录表达，及其在组织部位的表达量， 选取已鉴定为阳性植株的转基因水稻株系， 在花后10 d分别取根、茎、叶及未成熟胚乳总 RNA 用Act in为内参，进行定量 RT-PCR佥测。6种子萌发实验将经PCR鉴

30、定的转基因株系种子 （T1）收获后与同非转基因水稻品种在相同的条件下萌 发实验，一周之后观察种子发芽情况。为进一步研究该基因水稻种子萌发特性的变化及ABA和胁迫条件下的反应，选取经分子鉴定为稳定遗传的健康转基因种子（T2）, 50C打破休眠，采用不同浓度的 ABA溶液，以及75 mmol/LNaCl和200 mmol/L甘露醇溶液浸泡种子，观察 记录其萌发。§基因枪轰击法转小麦1. 培养基的配制1 ）愈伤组织诱导及继代培养基MS基本培养基+ 2 mg/L 2,4-D+ 30 g/L 蔗糖+ 7 g琼脂/L , pH为5.6-5.8。在此培养基中，培养前两周附加 0.5 mg/L AB

31、A2 ）高渗培养基MS基本培养基+ 2 mg/L 2,4-D+ 0.4 mol/L 甘露醇+ 30 g/L蔗糖+ 7 g琼脂/L , pH为5.6-5.83 ）分化筛选培养基MS 基本培养基 +1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+3-5 mg/L bialaphos+0.7% 琼脂 +3嘛糖， pH5.6-5.84）生根筛选培养基1/2MS 基本培养基 +0.5 mg/L IAA+1-2 mg/L bialaphos+1.5 mg/L多效唑 +3%蔗糖 +0.7%琼脂，pH5.6-5.8以上所有培养基均采用常规方法灭菌，选择剂 Bialaphos及激素均采用过滤灭菌，培 养基冷却至60 C左右时加入。2. 微弹的制备称取50 mg金粉（直径为1.0 um）放入1.5ml离心管中，加入1 ml 96%的酒精充分振荡30 s，使金粉充分散开，12000rpm离心1 min，除去上清液，再加 1 ml 96%乙醇重悬金粉， 重复上述步骤 3次。至完全除去乙醇后，加入 1 ml无菌水制成浓度为 50 mg/ml的金粉悬浮 液，用前吸取 50 ul金粉悬浮液至 Eppendof管中，加入质粒 DNA 5 ul （1 ug/ul ），振荡 混匀，再依次加入 50 ul 2.5 mol/L 的CaC"和20 ul