表达质粒的构建

1、表达质粒的构建、表达载体的构建表达载体是指具有宿主细胞基因表达所需调控元件，能使克隆的基因在宿主细 胞内转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞 内扩增;表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。外源基因在受体细胞内表达 与否及表达水平受到许多因素(调控元件)的制约。1、正确的阅读框架外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。 外源基因只有在它与载体DXA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架中， 从而表达融合蛋口，使外源蛋口与宿主蛋口相融合。2、H的基因有效转录的启动子启动子是DNA链上一段能与DNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列

2、，它是 基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是有两段彼此分开且乂高度保守的 核甘酸序列组成的，分别称为-35区和-10区。-35区序列为TTGACA, -10区的序 列为TATAAT。两序列之间的最佳间距为17bPo可与RNA聚合酶结合，并指导该酶 在正确的转录部位开始合成mRNAo山于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动 子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表 达载体启动子的转录常常是可以控制的，一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就 能转录，带动外源基因的高效表达。(1)大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受c I编码的阻遏蛋口 调节控制(2

3、)大肠杆菌的trp启动子是色氨酸操纵子启动子，受trpR编码的阻遏蛋口 调节控制(3) tac启动子，ill lac启动子的TO区和trp启动子的-35区融合而成，汇合 了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控制(4) lacUVo启动子是经紫外线诱变改造的lac启动子，该启动子失去了CAP和cAMP的证调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录(5)噬菌体的入P启动子是X噬菌体左、右向启动子，是一个温度敬感的阻 遏蛋、LR口受温度调控的很强的启动子(6) T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7RNA聚合酶所识别。pET宿主是

4、大肠杆菌BL21 (DE3), BL21 (DE3)是一株带有由lacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌。3、 转录终止子为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多 克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子。否则合成的mRNA过长， 不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。4、mRNA有效翻译的SD序列在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点也调节着mRNA的翻译，一 个是起始密码(AUG或GUG),另一个是位于起始密码上游311个核甘酸处的由39个核昔酸组成的一段保守序列AGGAGGU,称为SD序列。

5、而核糖体和mRNA的结合是Ill SD丿了;列以及与起始密码AUG之间的距离决定的。SD序列与AUG间隔9个碱基最 为合适。5、转录、翻译后的适当修饰和加工6、信号序列*融合蛋口的优点:融合蛋白、端山正常的大肠杆菌本身序列所控制，容易获得 高效表达;融合蛋口往往不被大肠杆菌视为异己蛋口，更为稳定。*在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，他直接决 定其编码的氨基酸的序列，并且直接影响蛋白质的功能。如果ORF内碱基对发生缺失突变或 插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而得到 一个截然不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止

6、密 码子，就会产生提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。*为了使外源基因在原核细胞中高效表达，应利用蛋口酶缺陷型的宿主，如用Ion（黃嚓吟核昔）营养缺陷型宿主减少外源蛋白的降解，因为Ion是大肠杆菌合成 蛋白酶的主要底物。二、外源基因的诱导表达外源基因在原核生物中高效表达除了有合适的载体外，还必须有合适的宿主菌 以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达至关重要，因为外源基因在细菌中的表达往往 不稳定，常常被细菌中的蛋口酶降解，有必要对细菌菌株进行改造，使蛋口酶的合 成受阻，从而使表达的蛋口得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JM109、BL21等大肠杆菌菌株。通常表达质粒不应使

7、外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外 源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细菌的生长。为 此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的，笫一阶段使含有外 源基因的宿主细胞迅速生长，以获得足够量的细胞;第二阶段是启动调节开关，使 所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。在原核基因表达调控中，阻遏蛋口与操纵基因系统起着重要的开关调节作用。当阻遏蛋口与操纵基因结合时，阻遏基因的转录，加入诱导物后，使其与阻遏蛋口 结合，解除阻遏，从而启动基因转录。*进行诱导实验中要注意应以含空载体的菌株以及IPTG诱导前的含有重组子的 菌株作对照。*I

8、PTG诱导的最终浓度为*诱导后的培养时间一般不超过3 h*有些工程菌，在IPTG诱导后，其发酵温度降低为30?,则可产生诱导蛋白。诱导表达蛋口时应注意调整诱导培养温度，不同的蛋口可能有不同的要求。三、 分析被检测基因在细胞中转录和翻译的情况1、Northern杂交，检查细胞中是否含有特定的mRA2、SDS-PAGE分析诱导前后细胞中忖的蛋口质的表达水平3、在Wenstern杂交中用特异性抗体分析L1的蛋口质的存在及含量4、 利用免疫学方法检测基因表达的强度5、直接测定LI的蛋白的生物活性，根据活性大小估计蛋白质的表达量6、将报告基因克隆在LI的基因的下游，根据报告基因的转录或翻译情况，估 计L

9、I的蛋口的表达量。四、 估计蛋白的相对分子量1、Mr=115*n/3（n是基因的碱基数）32、1. 0 kbDNA相当于333氨基酸，即相对分子量大约为37*10的蛋口质 五、 常用表达载体1、非融合蛋口表达载体与天然蛋口质在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致。山于要表达的基因 在克隆至载体时，其SD序列与ATG之间的距离等影响翻译的因素不一定安排的合 理，所以可能得不到理想的表达。PKK 223-3:含有核糖体结合位点和ATG密码子的基因，插入多克隆位点的任何 酶切位点均可表达;如果插入基因的起始密码子距EcoR I位点小于8 bp,也可利 用质粒上的核糖体结合位点进行表达。PBV2202

10、、融合蛋口表达载体这类载体的SD-ATG距离已固定，翻译起始信号组织合理，用这类载体表达的 蛋白常在端或C端融合有一段细菌多肽或蛋口质，有利于产物检测和纯化。由三种不同可读框的质粒组成系列载体，可根据情况选用以保证读码正确。pGEX系列pRSET系列PET载体:基础表达控制严格;强有力表达调控系统;提供各种不同需要的融合标 签和表达系统配置;提供可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白质外运以及多肽生产 等专用载体和宿主。六、提高表达水平（不同获得理想的表达）1、改用融合表达蛋白载体，提高表达的稳定性和产量2、改用更强的启动子以提高mRNA产量，并在基因下游加入稳定mRNA的强终 止子3、调整SD-ATG距离4、改用蛋口酶缺陷型宿主，或在宿主菌内表达蛋口酶抑制剂5、改用分泌型表达模式，以减少反馈抑制或蛋口酶降解6、适时加入诱导物，以防过早大量表达LI的基因而影响宿主细胞的繁殖7、根据密码子简并性，减少H的基因中稀有密码子的比例