医药PI染色检测细胞周期PROTOCOL共3

1、【医药】PI染色检测细胞周期 PROTOCOL共3页）PI染色检测细胞周期protocol1、离心收集细胞，弃上清，用预冷 PBS洗细胞两次。2、加入预冷70聽醇，于4?固定过夜，或-20?长期固定（4?过夜一般隔天就进 行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20?，有资料说-20?可以保存一个月，个 人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间 对检测结果的影响）。3、细胞染色离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入 500uLPBS含50ug/mL溴化乙 锭（PI），100ug/mL

2、RNase A, 0.2% Triton X-100）4? 避光孵育 30 分钟（PI 我是直 接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀， RNA酶现加，但有时不加发现对 实验结果也没太大的影响）。4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数 2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。- - 9 - - - - k - - kLZ-'RV细胞周期流式后一般分为 G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1期 前面有个凋亡峰（也称sub-G0期）,而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最

3、前面t t it T 厂丁 - 11t nr社和*畀申L甘-占LSOftFlf P2 « 02T还有细胞碎片峰fwrs ”T：i畀 a?4 EFJfi财 J IS 皿了 TVi，1 rv,- f “吓OiDl>d 1 0£ CK? TDIG M Z9X*r JS 7C DI 谅：13.0? *41 9! 4S 钏.岂：5 5i&t*L.ls >PIWH：芒.殆戈 伽 |i*D 0 I? W吋 fl. 413 S "t J”-3 1心 % lF"T“rnW If, a i ev>*er- i m耳i 严 |c T "&#

4、39; h Ki C F± nN I £ - 3 KS l.*O>结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%,峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43S期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%,细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。一般CVK小，峰形越好，越尖锐。能控制在5流右是比较好的结果，一般小于10%t可以认可了。Flow Cyt

5、ometric Analysis of Cell Cycle Fixation61) Collect 2 x 10 cells.2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4?C for 5 minutes.3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS. 4) Fix cells by adding4 ml of -20?C absolute ethanol. 5) Store cells at -20?C in this fixationbuffer until ready for analysis. (No

6、more than 2 weeks)Staining6) Centrifuge (as above) fixed cells and resuspend pellet in 1 ml ofPBS.7) Add 100 卩 l of 200 卩 g/ml DNas-eree, RNaseA and incubate at 37?C for 30 minutes.8) Add 100 卩 l of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubateat room temperature for 5-10 minutes.9) Place

7、samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on BectonDickinsonFACStarPLUS.PI 染液配制(100ml):PI 5mg、RNase 2mg 1.0%Triton X-100 0.25ml 、生理盐 水 65ml、枸橼酸纳100mg加蒸馏水至100ml，调pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4? 避光保存。注意事项 :1 在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞 ;2 固定液 :70%酒精 要在-20 预冷 ;3 细胞要选用活力高的。流式细胞 PI 单染中为什么用 RNAse,在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透

8、过细胞膜和DNA吉合，但 RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse笔解RNA。这样PI只染 DNA，能精确以荧光强度反映DNA勺含量。做流式细胞时， PI 染色， PI 的浓度应该是多少 ?还有就是 400 目的筛网是什么 100ug/ml ，一般用 400目勺筛网是用来将粘在一起勺细胞团滤掉勺，否则会出 现人为勺多倍体干扰，分析勺时候需要勺是单个勺细胞，不过如果经验丰富也 可以 gate 掉勺。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹勺很散，再进行染色PI 勺配置deardeer:PI 怎样配制, 怎样保存 , 有勺文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有 影响吗, 如果不这样，那

9、直接加入而不用柠檬酸钠溶解可以吗 ,an dywa ng:我用来做流式的 PI配制方法是：5mg PI +0.1ml Trit on X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。为储存液，用时稀释 10倍。任脉 任脉二四会阴曲，中极关元石门居，气海阴交入神阕，水分下脘连建里，中脘 上脘巨阕平，鸠尾中庭膻中行，玉堂紫宫连华盖，璇玑天突廉泉承。督脉督脉二八起长强，腰俞阳关命门当，悬(L1)脊中(T11)连中枢(T10)，筋缩(T9) 至阳灵台 (T6)上，神道（T5）身柱（T3）陶道（T1）行，大椎哑门风府中，脑户强间上后顶，百会 前顶囟会从，上星神庭素髎过，水沟兑端龈交

10、中。肺经肺经十一中府云，天府 （下3）侠白（下4）尺泽深，孔最 （上7）列缺经渠涉，太渊 鱼际少商寻。 心经心经穴位九穴真，极泉青灵 （上3）少海深，灵道通里阴郄至，神门少府少冲寻。 心包经心包经计九穴整，天池天泉 （ 下 2） 曲泽行，郄门间使内关入，大陵劳宫及中冲。 大肠经大肠二十起商阳，二间三间合谷旁，阳溪偏历 （上3）温溜（上 5）过，下廉上廉 三里上，曲池肘髎手五里，臂臑肩髃巨骨当，天鼎扶突禾髎香。小肠经小肠经计十九整，少泽前谷后溪行，腕骨阳谷可养老，支正（上5）小海过肩贞，臑俞天宗及秉风，曲垣肩外俞（T1旁3）肩中（C7旁2）,天窗天容上颧醪,最后一 穴是听宫。 三焦经三焦穴位二十

11、三，关冲液门中渚满，阳池外关支沟配，会宗三阳（上4）四渎（下5）连，天井续接清冷渊 （天井上 1），消泺臑会 （肩髎下 3）肩髎悬，天髎 （肩井连曲垣 中点）天牖起翳风，瘛脉颅息角孙同，耳门和髎丝竹空。胃经胃经穴位四五整，承泣四白巨髎经，地仓大迎下颊车，下关头维过人迎，水突 气舍下缺盆，气户库房屋翳深，膺窗乳中连乳根，不容承满及梁门，关门太乙滑肉 门，天枢外陵大巨轮，水道归来连气冲，髀关伏兔阴市中，梁丘犊鼻足三里，上巨 条口下巨丰，解溪冲阳陷谷旁，内庭厉兑经穴终。膀胱经膀胱六七起睛明，攒竹眉冲曲差 （上 0.5 旁 1.5） 行，五处（上 1）承光（上2.5） 上 通天（上4），络却（上5.5

12、）玉枕（后上2.5旁1.3）天柱（旁1.3）擎，大杼（T1旁1.5） 风门肺俞连，厥阴心督膈肝胆，脾胃三焦肾气海，大肠关元小肠悬，膀胱中膐白环 绕，上髎次髎中下髎，会阳承扶殷门 （下 6）过，浮郄委阳委中高。 附分魄户膏肓 输，神堂譩僖膈关入 , 魂门阳纲过意舍，胃仓肓门志室住，胞肓秩边连合阳，承筋 （下 5）承山及飞扬，跗阳 （上 3）昆仑仆参居，申脉金门京骨束，通骨至阴经穴已。胆经 胆经四四瞳子髎，听会上关颔厌好，悬颅悬厘连曲鬓，率谷天冲浮白绕，窍阴 完骨本神 （上 0.5 旁 3）妙，阳白临泣 （上 0.5 旁 2.25） 目窗（上 1.5） 高，正营（上 2.5） 承灵（上 4）连脑空

13、（后上 2.5） ，风池肩井渊液 （腋下 3 肋 4）中，辄筋 （渊液前 1）日月 （肋 7旁 4）京门当，带脉五枢维道行，居髎环跳过风市，中渎 （上 5）阳关阳陵交 （上 7），外丘（上 7）光明阳辅高，悬钟丘墟足临泣，地五侠溪窍阴了。脾经脾经穴位二十一，隐白大都太白抵，公孙 （一跖骨基底节前下 ）商丘三阴交，漏 谷（踝尖连阴陵，上 6）地机（踝尖连阴陵，下 3）阴陵系，血海箕门 （血海上 6）冲门 （旁 3.5） 升，府舍（脐下 4旁 4）腹结（下 1.3） 大横排，腹哀 （上 3）食窦（肋 5 间旁 6） 连天溪（肋 4 间旁 6），胸乡（肋 3）周荣（肋2）大包（肋 6间腋中）来。肾经肾经穴位二十七，涌泉然谷 （ 舟骨粗隆下 ） 与太溪，大钟水泉 （ 太溪下 1） 及照 海，复溜 （太溪上 2）交信（溜前 0.5） 筑宾（溪上 5）系，阴谷（半腱半膜间 ）横骨（脐下 5旁 0.5） 连大赫（下 4），气穴四满中注起，肓俞 （