细胞凋亡途径

1、彼岸花 524332169细胞的凋亡凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , lAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族，包括XIAP, C-IAP1, C-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAR Apollon 和 survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游caspases的蛋白不同，IAPs是唯一的内源性 caspase抑制物【1】。Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学 Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(eff

2、ector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。1.Survivin的分子结构IAP家族蛋白一般在 N末端含有23个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复 序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR,发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的

3、C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1, BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。Ambrosini等【4】测定并绘出了 Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin基因与EPR-1基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋 白，分子量约为16.

4、 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个a卷曲螺旋结构，不 含环指状结构域【5】。Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin- EX3另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin- EX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降 。2004年Badran A等7发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B,survivin-3B含有5个外显子，比survivin多3B外显子，survivin-3B包

5、含单一的BIR,这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2 a发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清 楚，初步认为survivin- EX与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2 a能减弱survivin的抗凋亡活性7。Survivin的异构体如图 1。彼岸花 524332169Um* 斗 rnUhJK *uwf vin_ w $ nNEm<mi 3 E*on 4 mRNA fturvivin 2B*-«. I LMMt4 1XUT

6、R rrtRNA survivin x£k3-* 立 &MHR 工品 mRNA *urvivin 3ES询3Z -玄 ura r II1H N A Murvivifi t图1: Survivin异构体外显子结构 Survivin基因片段有4个外显子；Survivin-2B则在2,3 号外显子间多出 2B外显子；Survivin- EX显示3号外显子缺失，并且读码框架延伸至ORF的3'非翻译区（3'UTR）； Survivin-3B除含survivin常规片断所有的外显子外，在3,4号外显子之间多一外显子3B。survivin-2a包含两个外显子，3'为

7、197bp非翻译区（3'UTR）。Survivin与其他IAP家族成员不同有以下三点，哺乳动物的lAPs中往往含有重复23次的BIR单元，这一序列是其凋亡抑制作用的基本要素，而survivin是迄今发现的IAPs中惟一的含单个BIR单元的成分；Survivin的BIR中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基 Pro、Trp和cys, survivin通过这些残基与 caspase-3和caspase-7结合抑制 caspase的活性， 阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡；survivin中还含有一个独特的由42个氨基酸严格排序形成的双螺旋区域。其可能与survivin的抗凋亡功能有关。2.

8、Survivin组织分布Survivin的分布不同于凋亡抑制蛋白家族其它成员，与IAPs在正常成人组织中广泛分布的模式相反，生理状态下，在成人除子宫内膜组织、胎盘、胸腺、结肠基底内皮细胞【9】、血管再生术时的神经干细胞【10】中发现存在不同程度的survivin基因表达外，大多数组织均测不到survivin基因表达，它只分布于胚胎组织和肿瘤组织。Survivin在绝大多数肿瘤组织中表达，包括肺癌，乳腺癌，结肠癌，胃癌，食管癌，胰腺癌，肝癌，膀胱癌，子宫癌， 以及卵巢癌，非霍其金淋巴瘤，白血病，神经母细胞瘤，脑瘤，嗜铬细胞瘤，软组织肉瘤， 黑色素瘤和其他皮肤癌。【9】并且发现survivin的表

9、达也发生在癌前病变的组织中。研究表 明survivin的表达增高出现在肿瘤发展的早期，并且在发生侵袭前就可出现表达上升11。随着肿瘤的发展，Survivin的表达量也随之增高，与Survivin能够抑制肿瘤细胞的凋亡、促使肿 瘤发展有关。Survivin的表达与肿瘤患者的耐药性、预后及5年生存率呈正相关。3. Survivin调控细胞周期Surv ivin的表达与细胞增殖有关，能够同时调控细胞增殖和凋亡。Kobayashi等12发现，有细胞增殖的组织均有survivin的表达。Survivin在胚胎组织中规律性表达，从而促进细胞的生长、分化。Survivin是已知的IAP家族中惟一与纺锤体微管

10、相关的蛋白质，有丝分裂的纺锤体对有丝分裂早期的染色体分离起重要作用，它具有监测有丝分裂纺锤体聚集的作用，survivin的表达存在细胞周期调控依赖性，在G2/M期其表达显著升高，与有丝分裂纺锤体微管蛋白，着丝点胞内中心体相关【13】。在有丝分裂初期，survivin可能是通过其梭基端的卷曲螺旋与组成有丝分裂纺锤体的微管蛋白特异性结合，与细胞周期调节因子CDK4形成survivin-CDK 4复合体，使得p21从与CDK4的复合体中释放出来与线粒体caspase-3结合，间接抑制其活性，而阻止细胞凋亡，使 caspase-3不能有效地水解微管结构蛋白，因而维持了 纺锤体的完整性，确保细胞有丝分裂

11、正常进行，从而导致多核细胞纺锤体蓄积【14】。如干扰 survivin与微管的结合，可致survivin抗凋亡活性丧失。【15】Surv ivin主要通过两种方式作用于细胞周期：使细胞周期免受p21蛋白的抑制。Survivin蛋白、丫微管蛋白和P21蛋白结合成复合物，共同定位于中心粒。P21蛋白被结合在 中心粒上，细胞周期的负向调节减弱，细胞进行分裂的速度加快。而Survivin蛋白受到拮抗时,P21发挥调节细胞周期的功能，使细胞周期阻滞在分裂期。与周期素依赖蛋白激酶CDK4结合，导致P21蛋白自CDK4的解离。P21紧密结合于G期和S期的蛋白激酶(CDK4和CDK2), 抑制其活性，对细胞增

12、殖停留在G1期具有重要的作用。而 P21的解离使CDK4活化，细胞进入增殖周期，最终导致大量细胞无限制增殖。Survivin如果过度表达，细胞失去正常增殖周期中凋亡 开关”的限制，造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡的平衡打破，最 后导致癌症的发生。Survivin的表达具有细胞周期依赖性，只在细胞周期的G2/M期表达。在有丝分裂的开 始，surv ivin与纺锤体的微管蛋白特异性结合，维护有丝分裂的正常进行。干扰surviv in和微管蛋白的反应，可致survivin抗凋亡活性的丧失，增加Caspase-3的活性，导致细胞的G2/M期凋亡， 细胞分裂异常，伴有多倍体细胞形成。这些结果提

13、示，在细胞周期的G2/M期,survivin能对抗异常因素诱导的细胞凋亡，而在肿瘤细胞中survivin的过度表达，则可能使细胞克服这个凋亡 的调控点而利于转化细胞，完成异常的有丝分裂。Surv ivin参与细胞凋亡细胞凋亡有两条途径：外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。外源性凋亡途径，又称为死亡受体通路，是由胞外肿瘤坏死因子(TNF)超家族的死亡配体如TNFa FasLZCD95L、TWEAK和TRAIL引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体(分别是 TNFR Fas/ CD95 DR3 DR4/ DRS结合，使受体三聚化 (receptor clustering )并激活， 三聚化的死亡受体

14、通过死亡域(deathdomain)募集衔接蛋白如TRADD和(或)FADDt衔接蛋白通过死亡效应域(deathefecterdomain , DED)与 pro caspase8形成复合物，称为死亡诱导 信号复合物(death inducing signaling complex , DISC。Pro-caspase-8 具有弱的催化活性，在 DISC中局部浓度升高，可发生自我剪接并活化。活化的caspase8释放到胞质中启动 caspase 的级联反应，激活下游的效应caspase,导致细胞凋亡。激活的caspase8能使胞质中的Bid 断裂成tBid , tBid转移到线粒体上，诱导细胞

15、色素C从线粒体释放进人胞质，从而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号。内源性凋亡途径，又称为线粒体/细胞色素C介导的通路，线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1 (Apaf-1)结合，使其形成多聚体，并促使 pro-caspase-9与其结合形成凋亡小体(apoptosome),之后激活caspase-9,被激活的caspase-9能激活其它的 caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡【16

16、】。Survivin可能主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和Caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；Survivin与周期蛋白激酶CDK4, CDK2相互作用阻断凋亡信号转导通路。Survivin直接作用 Caspase,主要通过抑制 Caspasc-3和Caspasc-7的活性，Survivin也可通过P21间接抑制Caspase Survivin与细胞周期调控因子 CDK4结合,导致CDK2 / cyclin - E 激活和核糖体（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后启动细胞进入周期，加快G1/S期的转换，使P21从Survivin-CDK4复

17、合物中释放出来，与线粒体 pro-caspase-3结合，抑制caspase-3活 性，阻止线粒体释放Cyt-c,抑制细胞凋亡。一般而言，哺乳动物lAPs阻断了细胞死亡的一个 普通环节，即线粒体 Cyt-c的释放，直接抑制了终末效应酶Caspase-3, Caspase-7干预了Caspase-9的活性。同时survivin抵消了一大类凋亡刺激物的作用，包括IL-3、Fas Bax、Caspase-3 Caspase -7 Caspase -8和 TNF 等15。5. Surv ivin-治疗肿瘤的新靶点近年来，研究者注重于通过抑制survivin的表达从而达到诱导肿瘤细胞自发凋亡或者增强肿瘤

18、细胞对于凋亡因子的敏感性。多种抗凋亡方法被应用在肿瘤的治疗中，包括反义寡核苷酸、核酶、细胞周期阻断剂、siRNA survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。5.1反义寡核酸技术反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASODN）可以圭寸闭凋亡抑制基因的过表达，并增强化疗药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡，这正是当今肿瘤耐药逆转的一种新策略，目前备受关注。在许多肿瘤比如在肝癌、胃癌、神经母细胞瘤中应用 ASODN技术，均证实可抑制survivin 的表达。Kan war【17】等证实应用 ASODN能增强鼠EL-4胸腺淋巴瘤细胞对于免疫治疗的敏 感性，导入表达反

19、义寡核酸质粒的细胞相比于对照组抑制生长明显，导致细胞凋亡，李红玲等选择B细胞淋巴瘤细胞株 Rajj作为模型，脂质体介导survivin ASODN转染细胞，结果survivin ASODN抑制了 Rajj细胞的增殖并诱导 Rajj细胞的凋亡，且survivin mRNA和蛋白表达均明显 下降。蔡真等的研究同样表明，survivin ASODN能明显抑制增殖及诱导细胞凋亡，并提高细胞对药物的敏感性。5.2核酶核酶（Ribozyme,Rz）是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异地与靶RNA序列结合并加以切割，使mRNA表达水平下降，从而抑制靶基因的功能。Pennati等18报道了核酶介导的S

20、urvivin表达抑制方法，该核酶以Survivin mRNA的3'端外显子1中CUA-110为靶点，将核酶的编码序列替换了n 型腺病毒VA1基因中心区域的一部分，使其能在细胞内得到表达； 同时构建莫洛尼氏反转录病毒质粒，在其3 '端长末端重复序列（long terminal repeat , LTR编码VA1核酶组件，从而获得高表达效率。转导之后可获得两边 LTR都含有核酶表达组件的双拷贝 质粒。实验证明，对雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU-154和PC-3植入裸鼠右侧肋下的肿瘤 模型，核酶介导的Survivin表达抑制能引起 Caspase-9依赖的细胞凋亡和肿瘤生长抑制19

21、5.3细胞周期阻断剂细胞周期的运动受细胞周期调节因子的控制，这些调节因子在肿瘤细胞中的表达常常 发生异常改变。在肿瘤细胞中细胞周期正调控因子过表达，如周期蛋白（Cyclin,主要是CyclinD1、Cyclin E1）和周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinases，主要是 CDK4 CDK6）oCyclinD的主要功能是促使细胞通过G1期，Cyclin D激活CDK4 CDK6，使细胞渡过 G1期进入S期。在这个过程中，Cyclin D- CDK4复合物是渡过 G1期所必需的。在肿瘤细胞中细胞周期负调控因子低表达或失活，如细胞周期蛋白依赖性进入S期。在这个过程中，C

22、yclin D-CDK4复合物是渡过 G1期所必需的。在肿瘤细胞中细胞周期负调控因子低表达或失活，如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor ， CKI,主要 INK4A, INK4B, KIP1)。CKI 通过与CDK或CyclinCDK复合物结合，抑制CDK的活性，阻止细胞增殖、分化。P21蛋白为CKI重 要成员，相对分子质量为21 000。p21蛋白C端抑制DNA复制必需因子增殖细胞核抗原(prolife-erating-cell nuclear antigen , PCNA, N 端抑制 Cyclin E CDK2,并且 N 端 Cyclin E- CDK2抑制区也抑制细胞生长20。p21蛋白在细胞DNA受到损伤时，细胞快速做出反应，使细胞周期阻滞在G1期的过程中起到关键作用。正在分裂的细胞周期存在着多个检查点，用来不让受损的DNA进行复制以及受损的染色体不发生凝集。 当发现损伤，检测点发出信号，通过Cyclin D1被APC降解，释放出F21,对Cyclin E/CDK2复 合物产生抑制，完成了早期快速抑制的过程使细胞停止生长，进行修复，当细胞无法修复时，细胞凋亡机制将被启动，避免将DNA损伤带到子代