第10章免疫分析相关仪器

1、目 录第九章 免疫分析相关仪器第一节 酶免疫分析仪一、酶免疫分析仪的基本结构及工作原理二、酶免疫分析仪的性能评价和维护三、酶免疫分析仪的临床应用第二节 发光免疫分析仪一、发光免疫分析仪的基本结构及工作原理二、发光免疫分析仪的临床应用第三节 免疫浊度分析仪一、免疫浊度分析仪的基本原理与基本结构二、免疫浊度分析仪的临床应用第四节 时间分辨分析仪一、时间分辨分析仪基本原理与基本结构三、时间分辨分析仪的临床应用第五节 放射免疫分析仪一、放射免疫分析的基本原理二、放射免疫分析常用标记物三、放射性活度测定方法四、放射免疫分析仪的应用第十章 免疫分析相关仪器随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理论的建立，大

2、量免疫学分析技术被不断地创新、发明，极大地促进了临床免疫学检测项目的推陈出新和检测手段的自动化、智能化和网络化，而基于各种免疫分析技术的仪器也应运而生。本章将主要介绍临床上常用的几种免疫分析仪器。第一节 酶免疫分析仪一、分型及特点（一）酶免疫分析技术的分类酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）是目前临床免疫检验最常用的分析技术，具有灵敏度高，特异性强，试剂稳定，操作简单、快速且无放射性污染等优点。其基本原理是将抗原抗体反应的高度特异性与酶的高效催化作用相结合，其中酶作为示踪剂标记抗体（或抗原）并通过分解相应的底物来显色，以对细胞核标本中的抗原（或抗体）进行定位分析和鉴定或根

3、据显色的深浅在微克、甚至纳克水平上对其进行定量测定。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为均相酶免疫测定和非均相（或异相）酶免疫测定两种方法。均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI）测定对象主要是激素、药物等小分子抗原或半抗原，其测定模式为竞争抑制法，酶标记待测抗原，而试剂中有足够的针对待测抗原的抗体和酶的底物。整个反应都在均匀的液相中进行，待抗原抗体结合反应平衡后，即可直接测定结果，而无需分离结合和游离的酶标记物。均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定技术两种方法。非均相酶免疫分析法（heterogene

4、ous enzyme immunoassay）与均相酶免疫分析法最主要的区别是在抗原抗体结合反应达到平衡后，需采用适当的方式将游离的和结合的酶标记物加以分离，再通过底物显色才能测定抗原（或抗体）含量。根据试验中是否使用固相支持物作为吸附免疫试剂的载体，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，后者称为酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），是临床上应用最广泛的免疫分析方法。根据检测目的和操作步骤的不同，ELISA有可分为双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和IgM抗体捕获法。ELISA是临床上最常用的免疫分析方法，目前常用的酶

5、免疫分析仪都是基于ELISA技术，称为酶免疫分析仪。（二）酶免疫分析仪的类型根据固相支持物的不同而设计成的酶免疫分析仪可以分为微孔板固相酶免疫测定仪、管式固相酶免疫测定仪、微粒固相酶免疫测定仪和磁微粒固相酶免疫测定仪等。1微孔板固相酶免疫测定仪微孔板固相酶免疫测定仪简称酶标仪，有多种分类方法。根据通道的多少可分为单通道和多通道2种类型，单通道又有自动和手动2种之分。自动型的仪器有X、Y方向的机械驱动机构，可将微孔板上的小孔一个个依次送入光束下面测试，手动型则靠手工移动微孔板来进行测量。 在单通道酶标仪的基础上又发展了多通道酶标仪，此类酶标仪一般都是自动化型的。它设有多个光束和多个光电检测器，如

6、 12个通道的仪器设有 12条光束或 12个光源，12个检测器和12个放大器，在X方向的机械驱动装置的作用下，样品12个为一排被检测。多通道酶标仪的检测速度快，但其结构较复杂价格也较高。根据波长是否可调可分为滤光片酶标仪（波长固定的滤光片，如：405，450，490，630nm）和连续波长酶标仪（波长连续可调，一般递增量为1nm）。根据功能又可分为带紫外功能的酶标仪和 带荧光功能的酶标仪。与普通光电比色计相比，酶标仪主要有以下特点：比色液的容器不是比色皿而是用塑料微孔板，因其对抗原或抗体具有很强的吸附力；光束是垂直通过微孔板中的待测液；酶标仪通常使用光密度OD来表示吸光度。2. 管式

7、固相酶免疫测定仪应用管式固相载体的ELISA分析仪器不多，在我国应用的有： 1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配套试剂。试剂包括用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物ABTS。测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点定标。测定的精密度CV在3%左右。测定项目齐全，包括激素、肿瘤标志、心肌标志和感染性疾病的抗原、抗体等。 法国生产的是一种特殊形状的管式全自动ELISA的分析仪，配套使用一个特别的“试剂条”（reagent strip）。3. 微粒固相酶免疫测定仪美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径0.47m）作为

8、固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。以后的反应在膜上进行，用过滤方式洗涤。标记酶为碱性磷酸酶，底物为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。其后生产的作药物测定的荧光偏振分析仪与一体多项目全自动免疫分析仪也在检验实验室广泛应用。4. 磁微粒固相酶免疫测定仪磁微粒可用磁铁吸引与液相分离，是免疫测定中较为理想的固相载体，较早应用磁微粒作为酶免疫测定固相的是瑞士出品的分析系统，由分光光度测读仪、磁铁板和试剂3部分组成。试剂包括抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1m）

9、，FITC结合的特异抗体或抗原，碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原及底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯。其应用的抗FITC-抗体是与亲和素-生物素原理相同的间接包被系统，反应模式与电化学发光免疫测定亦相似。反应在试管中进行，基本上用手工操作。反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。二、检测原理酶免疫分析仪其实就是一台特殊的光电比色计或分光光度计，其基本工作原理都是分光光度法，在光电比色计或分光光度计的基础上根据ELISA技术的特点而设计。以临床免疫检验最常用的酶标仪为例介绍酶免疫分析仪的工作原理。图10-1所显示的就是单通

10、道酶标仪的工作原理图，可以看出其与光电比色计几乎完全相同。既可以使用和分光光度计相同的单色器，也可以使用干涉滤光片来获单色光，此时将滤光片置于微孔板的前、后的效果是一样的。光源射出的光线通过滤光片或单色器后，成为单色光束，再经塑料微孔板中的待测标本吸收掉一部分后到达光电检测器。光电检测器将接收到的光信号转变成电信号，再经过前置放大、对数放大、模数转换等模拟信号处理后，进入微处理器进行数据的处理和计算，最后的检测结果在显示器上显示并可以直接打印出来。（图10-1）图10-1酶标仪工作原理图三、基本结构以临床免疫检验最常用的微孔板固相酶免疫测定仪为例介绍酶免疫分析仪的基本结构。国际上微孔板式ELI

11、SA使用的载体多为96孔板，每个小孔可以盛放零点几毫升的液体，可以直接测定微板孔的吸光度（A）。全自动酶标仪用在大批量标本的检测中，不但提高了工作效率，而且测定结果的精密度亦得到改善。它可以将整个系统分为加样系统、温育系统、洗板系统、判读系统、机械臂系统、液路动力系统、软件控制系统等结构，这些系统既相互独立又联系紧密。加样系统包括加样针、条码阅读器、样品盘、试剂架及加样台等构件；温育系统主要由加温器及易导热的金属材料板架构成，温育时间及温度设置是由控制软件精确调控的；洗板系统是整个体系的重要组成部分，主要由支持板架、洗液注入针及液体进出管路等组成；判读系统由光源、滤光片、光导纤维、镜片和光电倍

12、增管组成，是酶促反应最终结果客观判读的设备。机械臂系统由软件控制，可以精确移动加样针和酶标板，并通过输送轨道将酶标板送入读板器进行自动比色，再将光信号转变成数据信号又回送到软件系统进行分析，最终得出结果。四、性能评价随着科学技术的发展，酶免疫分析仪已逐渐取代传统的手工法操作，并逐渐在各医院普及。目前国内已经初步建立起一套酶免疫分析仪性能的评价体系，其评价指标和方法主要有从以下几个方面进行。1. 滤光片波长精度检查及其峰值测定 可用紫外可见分光光度计（波长精度±0.3nm）对不同波长的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接近于零、峰值越大表示滤光片的质量越

13、好。2稳定度检测 仪器吸光度值在l0分钟内因漂移引起的变化量不应超过±0.005；电源电压220V变动±10时，仪器吸光度值变化量不应超过±0.005。3灵敏度和准确度 灵敏度：精确配制6 mg/L重铬酸钾溶液，加入200L重铬酸钾溶液于小孔杯中，以0.05 mol/L硫酸溶液调零，于波长490 nm（参比波长650 nm）处测定其吸光度应0.01；准确度：准确配制1mmo/L对硝基苯酚水溶液，然后以10mmol/L氢氧化钠溶液25 倍稀释之，加入200 L稀释液于小孔杯中，以10 mmol/L NaOH溶液调零，于波长490 nm（参比波长650nm）处检测，其

14、吸光度应在0.4（0.3950.408）左右。4通道差与孔间差检测 通道差：取一只酶标微孔杯以酶标板架作载体，将其（内含200L甲基橙溶液，吸光度0.5左右）先后置于八个通道的相应位置，用蒸馏水调零，于490nm处进行测定，连续测定三次，观察不同通道之间测量结果的一致性，通道差用极差值来表示；孔间差：选择同一厂家、同一批号酶标微孔板条（8条共96孔）分别加入200L甲基橙溶液（吸光度0.0650.070）先后置于同一通道，蒸馏水调零，于波长490 nm处检测，其误差大小用±1.96s衡量。5零点飘移 八只微孔杯分别置于八个通道的相应位置，均加入200L蒸馏水并调零，于波长490nm（

15、参比波长650 nm）处每30分钟测定一次，连续观察4小时，其吸光度与零点的差值即为零点飘移。6精密度评价 每个通道三只微孔杯，分别加入200L高、中、低三种浓度的甲基橙溶液，用蒸馏水调零，于波长490nm（参比波长650 nm）处作双份平行测定，每日两次，连续测定20天。分别计算批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度以及相应的CV（%）值。7线性测定 准确配制5个系列浓度的甲基橙溶液，用蒸馏水调零，于波长490 nm处平行检测8次，计算其均值。计算回归方程、相关系数r、标准估计误差Sy和样品的95测量范围x，其误差大小采用±1.96Sy衡量。8双波长评价 取同一厂家、同一

16、批号酶标板条（每个通道2条共24孔）每孔加入200L甲基橙溶液（吸光度调至0.0650.070）先后于8个通道分别采用单波长（490nm）和双波长（测定波长490nm、参比波长650nm）进行检测，计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。五、操作和维护（一）操作-流程图近几年各种各样的酶免疫分析仪在临床免疫检验中的应用越来越普及。其基本操作流程如图10-2所示。（二）维护正确熟练地使用酶免疫分析仪及定期检测与维护保养是保障设备最佳工作状态的基本条件。如果实验人员不能正确地使用仪器，在日常工作中，忽略了对仪器的维护保养，就不能确保仪

17、器保持最佳的性能，也不能保证仪器的稳定性、安全性和可靠性。最终影响检测结果的有效性和准确性，使临床医师难以对患者作出正确的诊断。酶免疫分析仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。具体包括以下几个方面：仪器应放置在无强磁场和干扰电压且噪音低于40分贝的环境下；操作环境环境空气清洁，避免水汽、烟尘，温度应在1540之间，湿度在15%85%之间；避免阳光直射，以延缓光学部件的老化；操作时电压应保持稳定；保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。另外，酶免疫分析仪还需要进行定期维护，包括日常维护和月维护。1. 日常维护 仪器外部的清洁：用柔

18、软的湿布，沾取柔性清洁剂轻轻擦拭仪器外壳，清除灰尘和污物；检查加样系统：用酒精棉签擦拭加样针外壁，避免蛋白类物质的沉积。检查加样针涂层是否有破损的迹象，必要时更换加样针；清洁仪器内部样品盘和微孔板托架周围的泄露物质，如果泄露物质带有病菌，则必须用杀菌剂处理；每日仪器工作结束后进行一次标准的洗液及洗液管路的维护：将洗涤管路从洗涤液瓶放到蒸馏水瓶，用蒸馏水清洗洗涤管道，防止形成盐类结晶堵塞洗涤管道，清洗结束时将洗涤管路从蒸馏水中放回洗涤液瓶；处理废液桶中的废液以及仪器垃圾箱内的一次性吸嘴，丢弃托盘内已使用过的微孔板。2. 月维护 使用仪器厂商提供的软件执行检查程序，并打印检查结果报告归档；检查所有

19、管路及电源线是否有磨损及破裂，如果破损及时更换；检查样品注射器及与之相连探针是否泄露及破损，如果有，则更换之；检查微孔探测器是否有堵塞物，如有则可用细钢丝贴着微孔底部轻轻将其除去；检查支撑机械臂的轨道是否牢固，并检查机械臂及其轨道上是否有灰尘，如有，可用干净的布将其擦净。接通接线板电源，打开酶标仪器开关，仪器开始自检，输入安全密码后，让仪器自动预热35分钟取出样品板，关闭仪器关 机开 机参数设置进入主菜单，选择选择测量模式以及某些参数（如：波长、滤光片、阈值设置、振动参数、报告种类等）将被测样品板放入酶标盘中，按”开始”键，酶标仪对样品板开始进行测试 样本测定测定结束后，保存测定结果，并用外置

20、打印机打印结果结果查询传送图10-2 酶标仪操作流程图三、酶免疫分析仪的临床应用1病原体及其抗体的检测 各型肝炎病毒、艾滋病病毒、EB病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、轮状病毒等病毒感染；链球菌、布氏杆菌、结核杆菌等细菌感染；血吸虫、肺吸虫、弓形虫、阿米巴等寄生虫感染。2免疫球蛋白和细胞因子、补体等 酶免疫分析仪除了可测IgG、IgM、IgA和IgE外，还可测抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗dsDNA、抗ssDNA等自身抗体；国外已有30多种细胞因子测定的试剂盒，国内也有IL-2、TNF等多种细胞因子检测的试剂盒。3肿瘤标志物 甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异抗原、CA125、CA-150。4激素 如HCG

21、、FSH、TSH、T3、T4、雌二醇、皮质醇等。5药物和毒品 药物如地高辛、茶碱、苯巴比妥；毒品如吗啡等。第二节 发光免疫分析仪发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，以检测抗原或抗体的方法。既具有免疫反应的特异性，更兼有发光反应的高敏感性，在免疫学检验中应用日趋广泛。一、分型及特点（一）发光免疫分析的基本种类根据示踪物检测的不同而分为荧光免疫测定、化学发光免疫测定及电化学发光免疫测定三大类。在常温下，某些特定的化学反应产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子；当其衰退至基态时，释放出的化学能量以可见光的形式发射，我们把这种现象称为化学发光（chemiluminescenc

22、e，CL）。化学发光免疫根据标记物的不同，有化学发光免疫分析、微粒子化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和生物发光免疫分析等分析方法。现临床以前三者较为常用。本节主要介绍目前国内临床应用较多的化学发光免疫分析仪和电化学发光免疫分析仪。根据标记物的不同有下列几种分析方法：1化学发光免疫分析 其标记物为氨基酰肼类及其衍生物如5氢基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)等。 2化学发光酶免疫分析 先用辣根过氧化物酶标记抗原或抗体，在反应终点时再用鲁米诺测定发光强度。 3微粒子化学发光免疫分析 其标记物为二氧乙烷磷酸酯等。 4生物发光免疫分析 荧光素标记抗原或抗体，直接或间接参加发光反应。5电化学

23、发光免疫分析 所采用的发光试剂标记物为三氯联吡啶钉Ru(bpy)32+N羟基琥珀酰胺酯。此种方法较常用。（二）发光免疫分析基本测定方法根据发光反应检测方式的不同，发光免疫分析又可分为液相法、固相法、均相法等不同方法。根据发光反应检测方式的不同可分为下列主要的测定方法。 1液相法 免疫反应在液相中进行，反应后经离心或分离措施后，再进行测定发光强度。所用分离方法包括葡聚糖包被的活性炭末、SephadexG25层析柱、第二抗体等。 2固相法 将抗原抗体复合物结合在固相载体(如聚苯乙烯管)或分离介质上(如磁性微粒球、纤维素、聚丙烯酰胺微球等)，再进行测定发光强度，此法较常用。试验原理与固相RIA和EL

24、ISA方法基本相同。3均相法 如同均相酶免疫测定一样，在免疫反应后，不需要经过离心或分离步骤，即可直接进行发光强度检测。其原理是某些化学发光标记物(如甾体类激素的发光标记物)与抗体或蛋白结合后，就能增强发光反应的发光强度。二、检测原理三、基本结构四、性能评价五、操作和维护（一）操作流程（二）维护一、发光免疫分析仪的基本结构及工作原理发光免疫分析技术以其独特的优越性得到迅速发展，各种相应检测仪器的自动化程度也越来越高。本章主要介绍目前国内临床免疫检验中应用较多的化学发光免疫分析仪、全自动微粒子化学发光免疫分析仪以及电化学发光免疫分析仪。（一） 全自动化学发光免疫分析系统全自动化学发光免疫分析系统

25、采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合，是一个全自动、随机存取、软件控制的智能分析系统，具有操作更灵活，结果准确可靠，试剂贮存时间长，自动化程度高等优点。而且所有的分析试剂、定标液以及控制信息都能自动地输入软件，大大地降低了手工操作带来的误差。1仪器检测原理 在反应体系中，固相载体用磁粉颗粒，其直径仅1.0m，大大增加了包被表面积，使抗原或抗体的吸附量增加，反应速度加快，清洗和分离也更加简单。仪器利用某些化学基团标记在抗原或抗体上，该化学基团被氧化后形成激发态，在返回基态的过程中释放出一定波长的光子，光电倍增管将接受到的光能转变为电能，以数字形式反映光量度，再计算测定物的浓度。这种免疫分析

26、技术又称为微量倍增技术，包括两种方法：竞争法：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，使标记抗原与抗体（或测定抗原与抗体）结合成复合物，多用于测定小分子抗原物质；夹心法（图9-4）：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物，多用于测定大分子的抗原物质。图9-4 吖啶酯标记的CLIA反应原理吖啶酯是该检测系统最常用的标记物，它是一种带有三个苯环的有机化合物，在酸性条件下很稳定，碱性条件下则容易被氧化而激发，释放出430nm的荧光光子，该反应在1s2s之间可出现一个峰值，3s4s内结束，且不需要加任何催化剂。具有非特异性干扰

27、少，化学反应简单、快速等优点，而且当吖啶酯被用作标记物与其大分子相结合时，并不减小所产生的光量度，从而增加了检测的灵敏度。用吖啶酯标记的化学试剂有效期可达一年以上。2仪器组成及特点 一般由主机和微机两部分组成。（1）主机部分：是仪器的运行反应测定部分，包括原材料配备部分、液路部分、机械传动部分、光路检测部分。材料配备部分包括反应杯、样品盘、试剂盘、纯净水、清洗液、废水在机器上的贮存和处理装置；液路部分包括过滤器、密封圈、真空泵、管道、样品及试剂探针等；机械传动部分包括传感器、运输轨道等；电路部分包括光电倍增管和线路控制板。（2）微机系统：仪器的核心部分，是指挥控制中心。其功能有程控操作、自动监

28、测、指示判断、数据处理、故障诊断等，并配有光盘。主机还配有预留接口，可通过外部贮存器自动处理其它数据并摇控操作，用于实验室自动化延伸发展。全自动化学发光免疫分析仪为台式机，其主要特点为：测定速度：每小时完成180个测试，从样品放入到第一个测试结果仅需要15分钟，以后每隔20秒报一个结果；灵敏度：可达10-15g/mL；样品盘：可放置60个标本，标本管可直接放于标本盘中，急诊标本可随到随做，无需中断正在进行的测试；试剂盘：可容纳13种不同的试剂，因此每个标本可同时测定13个项目；全自动条码识别系统：仪器能自动识别试剂瓶和标本管，加快了实验速度。3. 仪器操作 全自动化学发光免疫分析仪测定所用试剂

29、包括两种：固相磁粉和液相发光试剂。每套试剂可放置于试剂托盘的任意位置上，由仪器扫描标签条码后自动加样 。根据测定项目不同，试剂用量在50L450L之间。测定标本必须用血清，禁止用血浆，以防纤维蛋白将管路堵塞。其基本操作流程如图9-5所示。关 机取出试剂放入冰箱，清理废弃物，清洗探针后，关闭仪器开 机参数设置打开仪器电源，等待仪器自检，按 “STARTUP”键启动进入菜单，设定测量参数，放置检测试剂和消耗品将被测样品放入样品架，输入起始样品栏的位置和起始样品编号，选择样品的测试项目按已设定的参数和程序，按¡°Run¡±键仪器自动检测测定结束后，可以选择需要

30、浏览的结果，打印报告样本装载样本测定结果查询传送图9-5 全自动化学发光免疫分析操作流程图（二）全自动微粒子化学发光免疫分析仪系统采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成分以及药物浓度进行定量测定，具有高度的特异性、高度的敏感性和高度的稳定性等特点。1仪器检测原理 应用经典的免疫学原理，采用单克隆抗体试剂，以磁性微粒作为固相载体，碱性磷酸酶为标记物，发光剂采用AMPPD，小分子物质采用竞争法或抗体捕获法进行测定，而大分子物质采用夹心法（图9-6）进行测定。图9-6 碱性磷酸酶标记的ECIA反应原理AMPPD是碱性磷酸酶的底物，是一种灵敏度高、稳定性强的理想发光剂。传统的化学发光剂如鲁米诺、吖啶酯

31、等在反应过程中发出的光不稳定，为间断的、闪烁性发光，使得在反应过程中需要不断加入特殊的缓冲液来支持反应过程的进行，导致测试成本的升高。而AMPPD具有连续稳定的发光，极广泛的线性范围，使化学发光由理想状态变为现实。2仪器组成及特点 仪器由微电脑控制，可以定量检测多种项目，主要由以下几个部分组成：（1）传送舱：由两个独立的传送装置组成。一个是标本舱，另一个是试剂舱。此外它还包括标本杯/管探测器，内部条码识别器。（2）主探针系统：主探针系统由探针架、主探针、精密泵、超声波传感器组成。主探针负责把标本、试剂、缓冲液加入到反应管中。（3）分析系统：分析系统由反应管支架、反应管供给舱、恒温带和冲洗/光电

32、读取舱组成。它负责传送反应管，并且在传送过程中通过恒温带把反应管加热到一定温度，当恒温过程完成后，由光电识别装置把光信号转变为电信号。（4）流体系统：流体系统由冲洗液、废液、底物泵及阀、真空泵、贮水罐、液体箱和探针冲洗塔组成。（5）电子系统：电子系统由打印电路板、电源、硬盘驱动器、软盘驱动器、重启动按钮和内锁开关组成。外周设备：外周设备包括彩色监视器、打印机、键盘、外部条码识别笔、外部条码扫描器及连接臂。此类全自动微粒子化学发光免疫分析仪主要特点为：测定速度：每小时完成100个测试，从样品放入到第一个测试结果需要15 min30min；灵敏度：通过酶放大和化学发光放大，灵敏度达到甚至超过10-

33、15g/mL；样品盘：可放置60个标本，标本管可直接上机， 急诊可优先，标本随到随做，无需中断运行；试剂盘：可容纳24种试剂，因此每个标本可同时测定24个项目，试剂可随意添加；全自动条码识别系统：仪器能自动识别试剂盒和标本管条码，加快了实验速度。3. 仪器操作 全自动微粒子化学发光免疫分析仪可以真正的24小时待机，不但节省了初始化时间及成本消耗，而且可确保急诊检测。其操作也十分简单（图9-7），主要包括以下几个阶段：（1）抗原抗体结合：将包被单克隆抗体的顺磁性微粒和待测标本加入反应管中，标本中的抗原与微粒子表面的抗体结合，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复

34、合物。（2）洗涤和分离：在电磁场中进行2次3次洗涤，很快将未结合的多余抗原和酶标记抗体洗去；（3）加入底物AMPPD：AMPPD被结合在磁性粒子表面的碱性磷酸酶的催化下迅速去磷酸基因，生成不稳定的中介体AMPD。AMPD很快分解，从高能激发态回到低能量的稳定态，同时发射出光子，这种化学发光持续而稳定，可达数小时之久。通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。图9-7 全自动微粒子化学发光免疫分析仪流程图（三）全自动电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫分析是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。该技术是继酶免疫、化学发光免疫

35、测定之后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光和免疫测定相结合的产物。与其他免疫技术相比具有十分明显的优点：由于所用标记物三氯联吡啶钌可与蛋白质、半抗原激素、核酸等各种化合物结合，因此检测项目很广泛；由于磁性微珠包被采用“链酶亲和素-生物素”新型固相包被技术，使检测的灵敏度更高，线性范围更宽，反应时间更短。全自动电化学发光免疫分析仪采用均相免疫测定技术，不需要将游离相与结合相分开，从而使检测步骤大大简化，也更易于自动化。1. 仪器检测原理及过程 该类分析仪综合应用了免疫学、链酶亲合素生物素包被技术及电化学发光标记技术，将待测标本与包被抗体的顺磁性微粒和发光剂标记的抗体加在反应杯中共同温育，形成

36、磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。复合物吸入流动室，同时用三丙胺（TPA）缓冲液冲洗。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下的磁铁吸引住，而游离的发光剂标记抗体被冲洗走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钌Ru（bpy）32+在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。按照免疫学方法的原理可应用三种抗原抗体反应方法：抑制免疫法用于小分子量蛋白抗原检测；夹心免疫法（图9-8）用于大分子量物质检测；桥联免疫法用于抗体如IgG、IgM检测。钌标记还可用于DNARNA探针分析。图9-8 三氯联吡啶钌标记的ECLIA反应原理 2仪器

37、组成及特点 全自动电化学发光免疫分析仪为台式一次进样或随机进样自动化分析仪，主要由样品盘、试剂盒、温育反应盘、电化学检测系统及计算机控制系统组成。其基本操作流程如图9-9所示。仪器有以下特点：测定速度：每小时完成90个测试，从样品放入到出第一个测试结果需要9分钟或18分钟，根据测试的项目而定；灵敏度：由于采用链霉亲合素-生物素技术和电化学发光技术，灵敏度达到甚至超过10-15g/mL；样品盘：可放置75或3 0个标本，标本管可直接上机。由于采用急诊通道，急诊标本可随到随做，无需中断运行；试剂盘：可容纳6或18种试剂，并带有内置恒温装置，以利于试剂保存；全自动二维条码识别系统：仪器能自动识别试剂

38、盒、标准品、质控品和标本管条码，并读入测定参数等，减少人工输入的误差。图9-9 全自动电化学发光免疫分析仪二、发光免疫分析仪的临床应用由于发光免疫分析技术所具有的诸多优点，使得发光免疫分析仪器在临床的应用越来越广泛。主要包括以下几个方面：1甲状腺系统 检测总T3、总T4、游离T3、游离T4、促甲状腺素、超敏促甲状腺素、T3摄取量、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体、促甲状腺受体抗体等；2性腺系统 检测绒毛膜促性腺激素、泌乳素、雌二醇、雌三醇、促卵泡成熟素、促黄体生成素、孕酮、睾酮等；3血液系统 检测维生素B12、叶酸、铁蛋白等；4肿瘤标记物 检测甲胎蛋白、癌胚抗原、CA15-3、CA125

39、、CA19-9、2微球蛋白、前列腺特异抗原、游离前列腺特异抗原等；5心血管系统 检测肌红蛋白、肌钙蛋白、肌酸激酶-MB等；6血药浓度 检测地高辛、苯巴比妥、苯妥英钠、安茶碱、万古霉素、庆大霉素、洋地黄、马可西平等；7感染性疾病：检测Anti-HAV，Anti-HAV-IgM，HBsAg，Anti-HBc，Anti-HBs，Anti-HBe，HBeAg，Anti-HCV，HIV-Ag等；8其他 检测IgE、血清皮质醇、尿皮质醇、尿游离脱氧吡啶等。 第三节 免疫浊度分析仪一、分型及特点（一）发光免疫分析的基本种类二、检测原理三、基本结构四、性能评价五、操作和维护（一）操作流程（二）维护免疫浊度法（

40、immunonephelomytry）是利用可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过剩时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，当有光线通过时，就会产生折射或吸收，测定这种折射和吸收后的透射光或散射光，即可计算出样品的含量。该技术将现代光学仪器与自动分析检测系统相结合应用于免疫沉淀反应，可对各种液体介质中的微量抗原、抗体、药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定，免疫浊度测定是沉淀反应的一种形式，是液相中的沉淀反应。免疫浊度技术同其他免疫学分析技术相比，最大的优点是校正曲线比较稳定，简便快速，易于自动化，无放射性核素

41、污染，适合大批量标本同时检测。其缺点是特异性稍差，灵敏度还不够高，特别是对于单克隆蛋白和多态性蛋白的检测准确度稍差，易受血脂的影响，尤其是低稀释时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，造成假性升高，所以在使用方面受到一定限制。按照测定方式的不同免疫浊度法可分为散射光免疫浊度法（nephelometry immunoassay或nephelometry）和透射光免疫浊度法（turbidimetric immunoassay或turbidimetry）。前者是在5°96°角的方向上测量散射光强度和被测溶液中微粒浓度关系的方法，后者则是在180°角，亦即在直射角度上测定光透射强度

42、。免疫胶乳浊度测定法也是应用免疫透射比浊，它是利用一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝集时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝聚成正比。散射光免疫浊度法按测定方式的不同又可分为终点散射浊度法（end nephelometry）和速率散射浊度法（rate nephelometry）。前者是测定抗原与抗体结合完成后测定其复合物的量，后者是在抗原与抗体反应的最高峰（约在1分钟内）测定其复合物形成的量。几种方法皆有测量仪器可供应用。图9-10 散射光免疫浊度法和透射光免疫浊度法的区别示意图一、免疫浊度

43、分析仪的基本原理与基本结构随着免疫浊度分析技术的日趋成熟，各种各样的免疫浊度分析仪也应运而生，且自动化程度越来越高。以下介绍两种临床检验常用的免疫浊度分析仪。（一）ARRAY特种蛋白分析测定系统 1.仪器检测原理 该系统由微电脑控制，是一种可以定量检测体液中微量蛋白的全自动组合仪器。在抗体过量的前提下，悬浮于缓冲液中的抗原-抗体免疫复合物颗粒通过光束时产生的散射光速率变化，散射测浊仪检测出该信号的强弱与抗原浓度成正比，速率峰值经微电脑处理转换成抗原浓度。2. 仪器组成 一般由分析仪、计算机、打印机三部分组成。其中分析仪是系统的主要部分，包括散射测浊仪、加液系统、试剂和样品转盘、卡片阅读器、软盘

44、驱动器等等。（1）散射测浊仪：采用双光源碘化硅晶灯泡（400nm620nm） 作为光源。自动温度控制装置可将仪器温度恒定在26±1。化学反应在一次性流式塑料杯中进行，由固体硅探头监测反应过程。 （2）加液系统：包括自动稀释加液器，可以稀释标本，并将标本和试剂加到流动式反应杯中。另外，还有标本、抗体智能探针，具有液体感知装置，控制加液体积的准确性。（3）试剂和样品转盘 20孔试剂转盘可放置20种不同的化学试剂，或20种不同的抗体（包括抗原过剩试剂）。40孔样品转盘可放置待测标本和质控液。 （4）卡片阅读器：可读取卡片内贮存的对某一测定项目有用的参数，包括检测项目的名称、批号、标准曲线信

45、息和所需的稀释倍数等。这些参数值随检测项目和批号的不同而不同。因此每批抗体试剂和标准血清都会附有新的卡片。软盘驱动器阅读软盘中的操作指令，如数据输入、仪器功能运行等。3. 仪器特点 该系统测定方法具有敏感、精确、快速和简便的特点。全自动操作，一次可对40份标本进行20种免疫特定蛋白项目的检测，数分钟内可出结果并打印报告。其基本操作流程如图9-11所示。图9-11 ARRAY特种蛋白分析仪操作流程图 （1）速率信号的获取：散射测浊仪在检测标本时，散射光信号的第一次变化是反应缓冲液产生的。加入适当稀释的抗原后，出现第二次略微增强的信号，其强弱程度取决于标本的内容物和稀释的成分。最后加入抗体，出现第

46、三次信号变化，并逐渐增强直至抗原抗体反应到达终点。仪器在加入抗体后记录反应速率，然后由电脑通过标准曲线换算成待测抗原的浓度。另外，仪器一旦测到所需的速率峰值以后，通过峰值鉴定程序再对此峰值进行确证，以排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的干扰性散射光信号。（2）抗原过剩的监测：如果混合反应液中有游离抗体存在，再次加入抗原可出现新的速率峰值信号。如果没有游离的抗体存在，即抗原过剩时，就不会有或者只有很小的速率信号出现。在抗原过剩的情况下，仪器重新对标本进行更高倍数的稀释，然后再次进行测定。 （3）使用抗体、标准血清、抗体卡片和校正卡片：为了使抗体浓度与待测标本中抗原的浓度比例相适合，系统提供

47、的抗体，其浓度都已经作过调整，以取得最佳检测范围。每一种抗体卡片均提供最高检测限、最低检测限的信息。如果标本测出的速率值高于或低于上述极限值，仪器将自动更换合适的标本稀释度，然后重新进行检测。校正卡片贮存有标准曲线信息，是一条浓度对速率峰值的曲线。根据此曲线，仪器可将速率峰值单位转移成浓度单位。标准血清用于对仪器进行单点校准，以保证测定结果的准确度和精密度。（二）BN特种蛋白分析测定系统 BN特种蛋白分析测定系统（Behring Nephelometer）是用于免疫浊度分析的半自动分析系统。1仪器检测原理 该系统测定方法实质上是一种改良透射免疫浊度法。利用发光二极管（840nm）作为光源，检测

48、在前向角130240的散射光，由硅化光电二极管接收散射光信号，这种散射光的强度与免疫复合物浓度成正比。散射光电信号与贮存在计算机内的标准曲线进行比较，然后转换成检测物的浓度。2仪器组成 BN特种蛋白分析测定系统由分析仪、计算机、打印机、条码读取器四部分组成。分析仪是该系统的主要部分，包括散射测浊仪、自动加液系统、支架运输装置和比色杯装置。其基本操作流程如图9-12所示。图9-12 BN特种蛋白分析仪操作流程图 （1）散射测浊仪：光源采用发光二极管（840 nm±25nm），化学反应在塑料杯中进行，由固体硅探头监测反应过程，在前向角130240 由硅化光电二极管接收散射光信号。 （2）

49、加液系统：包括自动稀释加液器，具有稀释标本，将标本和试剂加到反应杯中的功能。另外，还有标本、抗体智能探针，具有液体感知装置，控制加液体积的准确性。 （3）支架运输装置：支架运输装置包括可放30个标准血清的试剂架、可放75个待测血清的试剂架、双排75孔用于血清标本稀释的支架和可放14个抗血清的试剂架。在测试过程中，必须盖好支架运输装置，以避免试剂的蒸发。支架运输装置的运动由光感器进行监测。 （4）比色杯装置：比色杯装置由9组类圆形比色杯（每组为5个比色杯）组成。这种奇数的比色杯装置，在连续两次旋转后回到原始位置，保证转动比色杯的连续充液、测定和吸出废液。这种装置由光感器监测、计算机控制整个运动过

50、程。在分析器开机之后，仪器自动对比色杯本底透光度进行检测，如果比色杯有5个超过规定的范围，则应清洗比色杯或更换新的比色杯。3. 仪器主要特点 （1）固定时间测定：该分析仪可以通过固定时间来检测血清特种蛋白浓度。固定时间法是利用两个时间光散射检测之间的差异，首先在免疫反应混合物预备10秒钟测定第一次光散射的值，然后在反应6min后测定第二次光散射的值。在这两点光散射强度的差异通过贮存在计算机内校准曲线进行比较，即可得出该物质的浓度。分析仪通过48个标准浓度对校准曲线进行校正。校准曲线可以贮存在计算机终端记忆器中7天。 （2）终点检测法：该分析仪通过终点法来检测用胶乳反应的血清特种蛋白浓度，终点法

51、是检测预温30min后光散射的值。因为胶乳颗粒具有较高的试剂空白值，所以测定空白值没有必要。通过终点光散射强度与贮存在计算机内校准曲线进行比较，即可得出该物质的浓度。二、免疫浊度分析仪的临床应用1免疫功能监测 免疫球蛋白A、免疫球蛋白C、免疫球蛋白M、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白轻链、补体C3、补体C4、C-反应蛋白等。 2心血管疾病检测 载脂蛋白A1、载脂蛋白B、脂蛋白、C-反应蛋白等。 3炎症状况监测 C-反应蛋白、1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白等。 4类风湿性关节炎的检测 类风湿因子、C-反应蛋白、抗链球菌溶血素O等。 5肾脏功能监测 微量白蛋白、1-微球蛋白、2-微球蛋白、转铁蛋白、

52、免疫球蛋白G等。 6营养状态监测 白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白等。 7新生儿体检 C-反应蛋白、免疫球蛋白A、前白蛋白、免疫球蛋白G等。 8凝血及出血性疾病的检测 抗凝血酶、转铁蛋白、触珠蛋白等。 9贫血监测 触球蛋白、转铁蛋白等。10血脑屏障监测 脑脊液白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M。11. 药物浓度的检测 丁胺卡那霉素、卡马西平、庆大霉素、苯巴比妥、苯妥因奎尼丁、妥布霉素等。第四节 时间分辨分析仪一、分型及特点（一）发光免疫分析的基本种类二、检测原理三、基本结构四、性能评价五、操作和维护（一）操作流程（二）维护免疫荧光技术（immunofluorescene techniq

53、ue）是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。20世纪70年代以来，在传统荧光抗体技术的基础上，根据放射免疫和酶免疫测定的原理，发展建立了各种免疫荧光测定法（immunofluorescene assay，IFA），可用于定量测定体液中抗原或抗体。与酶免疫测定一样，荧光免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的/游离的荧光标记物而分为均相和非均相两种类型。在抗原抗体反应

54、后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的Ag量，称之为非均相荧光免疫测定法，包括时间分辨荧光免疫测定（time-resolved fluorescence immunoassay， TRFIA）和荧光酶免疫测定（fluorescence enzyme immunoassay，FEIA），尤以前者最具代表性。如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物失去荧光特性，则不需进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag量，此方法称为均相荧光免疫测定法，包括荧光偏振免疫测定（fluorescence polarizati

55、on immunoassay，FPIA）和底物标记荧光免疫测定（substrate-labeled fluorescent immunoassay，SLFIA）。一、时间分辨分析仪基本原理与基本结构时间分辨荧光免疫是近十年发展起来的一种微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术，其灵敏度高达10-19g/mL，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。其基本原理是用镧系三价稀土离子如铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、镝（Dy3+）和铽（Tb3+）等及其螯合物作为示踪物标记抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应发生以后，将结合部分与游离部分分开，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、Stoke

56、s位移大、荧光半衰期长），用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光，测定免疫反应最后产物的特异性荧光信号。根据荧光强度判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay，DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它利用具有双功能基团结构的螯合剂，把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体上，经过免疫反应之后，部分标记物结合到固相载体上生成免疫复合物，未结合的标记物被洗掉。由于这种复合物在水中的荧光强度非常

57、弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。由于使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。该检测系统结构方框图见图9-13。图9-13 DELFIA检测系统方框图以DELFIA为例来介绍时间分辨荧光免疫的基本结构。Auto DELFIA为台式仪器，由样品处理系统、实验运行系统、检测系统和电脑数据处理系统四部分组成。样品处理系统一次可同时放置36架标本，每架可放12个原始样品管，总共可放432个样品，适合大批量检测。它具有全自动条码识别系统，可自动识别具有条形码的试剂管、样品管和96孔板等。固相载体是96孔塑料板，预先包被抗体或抗原以供使用，一般有效期为一年。96孔塑料板包被用的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，依据项目而定。抗原抗体反应后的洗涤由全自动洗板机完成。在解离增强之前，需要分离镧系元素（如