曼地亚红豆杉的组织培养方案

1、曼地亚红豆杉的组织培养方案一，基本培养基：MS培养基的配制:MS培养基配方浓缩倍数成分分子量使用浓度(mg/L)贮备液浓度（mg/L)配制1L培养基的用量(ml)10大量元素硝酸钾KNO3101.11190019000100硝酸铵NH4NO380.04165016500磷酸二氢钾KH2PO4136.091701700硫酸镁MgSO4.7H2O246.473703700氯化钙CaCl2.2H2O147.0244044001000微量元素碘化钾KI166.010.838301硼酸H3BO361.836.26200硫酸锰MnSO4.4H2O223.0122.322300硫酸锌ZnSO4.7 H2O2

2、87.548.68600钼酸钠Na2MoO4.2 H2O241.950.25250硫酸铜CuSO4.5 H2O249.680.02525氯化钴CoCl2.6H2O237.930.02525200铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA372.2537.374605硫酸亚铁FeSO4.7H2O278.0327.85560200有机成分肌醇100200005甘氨酸2400盐酸硫胺素VB10.120盐酸吡哆醇VB60.5100烟酸VB5或VPP0.5100蔗糖sucrose342.3135g/L琼脂agar 7g/L在制备这4种贮备液的时候，应将称量出来的各种成分分别放入一个烧杯中，加少量蒸馏水使之溶解

3、，然后再依次混合，以蒸馏水定容。对于铁盐来说，在定容后须将其放入棕色细口瓶中，盖严瓶塞，用力振荡12min，以防在保存过程中沉淀。配制铁盐：把七水硫酸亚铁和EDTA钠盐分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解，然后将2种溶液混合，把PH调到5.8，加蒸馏水定容到1L,置于细口瓶中，用力振荡12min,避光保存。经过保存的贮备液在每次使用前必须轻轻摇动瓶子，如果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即淘汰。B5培养基的配制：B5培养基的配方成分使用浓度(mg/L)大量元素硝酸钾KNO32527.5二水氯化钙CaCl2.2H2O150硫酸镁MgSO4.7H2O246.5硫酸铵 (NH4

4、)2.SO4134一水磷酸二氢钠 NaH2PO4.H2O150微量元素碘化钾KI0.75硼酸H3BO33一水硫酸锰MnSO4.H2O10硫酸锌ZnSO4.7 H2O2钼酸钠Na2MoO4.2 H2O0.25硫酸铜CuSO4.5 H2O0.025氯化钴CoCl2.6H2O0.025铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA37.3硫酸亚铁FeSO4.7H2O27.8NaFe-EDTA28有机成分肌醇100盐酸硫胺素VB110盐酸吡哆醇VB61烟酸VB5或VPP1蔗糖sucrose2%琼脂agar 二，材料及处理外植体消毒：我们用曼地亚红豆杉的休眠芽(经过一定时间的低温处理)或用曼地亚红豆杉的茎段作为实

5、验材料，从曼地亚红豆杉植株上取萌生的10 cm 长带芽的茎段,除去叶片(但保留叶柄) ,在自来水下冲洗2 4h ,用洗洁精泡洗10 min ,再用自来水冲洗干净。将材料放入高温灭菌过的三角瓶中加入70%（56%的深度效果最好)的酒精,浸30 s 后倒出酒精,用无菌水冲洗遍，再用0.1%0.2%HgCl2(升汞)进行消毒5min.消毒后均用无菌水冲洗45遍。置于洁净瓶子中。 另：于晴朗午后采健壮母株上的当年生枝条,在洗衣粉溶液中清洗浸泡30 min ,35 温水浸泡30 min ,剪切成1.5 cm 左右的带芽茎段,然后在无菌操作台上用70 %的酒精消毒30 s ,无菌水清洗1次,0.1 %新洁

6、尔灭消毒10 min ,无菌水冲洗3 次,0.1 %的HgCl2 连续2 次消毒共12 min ,无菌水清洗5 次 以嫩茎为外植体选择晴好天气, 剪下曼地亚红豆杉新生的嫩枝(长2 5cm ) , 用1% 2% 的洗衣粉水漂洗3 5 m in, 自来水冲洗干净, 移至超净工作台上, 先用70% 的乙醇处理50s, 再用011%HgCl2消毒3 5 m in, 无菌水漂洗5 7 次, 切成1 2cm 的小段, 保留半叶, 接种在诱导培养基上。 以嫩叶为外植体选择晴好天气, 剪下新枝中顶部的嫩叶, 用1% 2% 的洗衣粉水漂洗5 m in,自来水冲洗干净, 移至超净工作台上, 先用70% 的乙醇处理

7、50s, 再用011%HgCl2 消毒5 8 m in, 无菌水漂洗5 7 次, 每张叶剪成2 3 段, 接种在诱导培养基上。三，曼地亚红豆杉的组织培养： 1.愈伤组织发生：具有较强分生能力的新生茎段和叶片能够得到很高的诱导率,与萘乙酸(NAA)相比, 2, 4 - 二氯苯氧乙酸(2, 4 - D)在诱导中作用显著。在继代培养中, 2, 4 - D 比NAA 对愈伤组织生长的促进作用显著, 6 - 苄基腺嘌呤( 6 -BA)对愈伤组织生长的促进作用极显著。在第20 天就开始转移继代和提高愈伤组织与培养基接触面的氧气供给,能够较好控制褐化现象的发生。在含有5mg/L 2, 4 - D、0. 5m

8、g/L 6 - BA及1g/L 活性炭(AC)的B5培养基上,愈伤组织细胞增殖倍数最大达到4. 7,褐化也能得到部分控制。具有较强分生能力的新生茎段和叶片能够得到很高的诱导率, 与NAA 相比, 2, 4!D 在诱导中作用显著。含有3mg/L2, 4!D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6!BA 的MS 培养基有利于愈伤组织的诱导, AC 对愈伤组织生长作用不明显, 但AC 的使用使愈伤组织颜色保持为绿色, 能很好的抑制褐化的产生过高的活性碳对激素吸附严重, 影响愈伤组织的诱导. 提高NAA 的量可以减少愈伤组织诱导的时间 在继代培养中, 2, 4!D 比NAA 对愈伤组织生长的促

9、进作用显著, 6!BA 对愈伤组织生长的促进作用极显著。在继代培养中, 第20 天就开始转移继代和提高愈伤组织与提高培养基接触面的氧气供给能够较好克服褐化。在含有5 mg/L 2, 4!D +0.5 mg/L 6 BA+1 g/L AC 的B5 培养基上,愈伤组织细胞增殖倍数最大达到4.7, 褐化可得到部分控制B5 为基本培养基略优于M S。综合结果是, 以B5+ KT 110 mg/L + NAA 110 mg/L + 2, 42D 210 mg/L (1)B5 比M S 更适合作为曼地亚红豆杉继代培养的基本培养基; (2) 2, 42D 和NAA组合比单独使用更利于曼地亚红豆杉愈伤组织生长

10、;( 3) KT 为愈伤继代较好的细胞分裂素类激素, 在合适的培养基成分和培养条件下, 每30d 的增殖系数达5.2 倍。 在培养基中添加抗竭化试剂, 有利于曼地亚红豆杉愈伤的继代培养, 其合适的种类和浓度分别为: 活性碳500mg/L , 维生素C1000 mg/L , 水解乳蛋白1000Mg/L。曼地亚红豆杉愈伤组织诱导培养基中, 生长素与细胞分裂素的比例应在101 左右; 2 , 4 - D与NAA 的比例应在21 左右。当年生茎段是进行曼地亚红豆杉愈伤组织诱导的较好外植体, 愈伤组织生长也较好。暗培养条件更有利于愈伤组织的诱导, 诱导率高, 且诱导出的愈伤组织质量好。35 温水浸泡30

11、 min 的处理对抑制褐化有理想的效果, 外植体褐化现象得到了极大抑制。 继代培养基为B5 + 2 mg/L - 2 ,4D + 0.5mg/L 6BA + 1 g/L AC. 2.有效的芽分化培养基及激素配比： 3.组培苗生根培养基及激素配比 WPM + 6BA 0.05 mg·L- 1 + NAA1.0 mg·L - 1是曼地亚红豆杉较适宜的生根培养基。4.腋芽直接诱导丛生芽的方法 MS + 6BA 0.05 mg·L- 1 + NAA0.5 mg·L - 1是曼地亚红豆杉腋芽增殖启动培养的适宜培养基。细胞分裂素对芽的诱导有利,但对芽的生长抑制作用明

12、显,浓度稍高,有效芽率便明显下降。生长素对芽伸长的抑制作用不明显。不添加生长调节物质的MS(有机物加倍) 培养基是曼地亚红豆杉侧芽继代培养的适宜培养。 5.组培苗炼苗移栽方法 由外植体直接诱导生根的培养苗,在生根培养基上的根长到34 cm时(约90100 d) ,将培养瓶移至自然温度下揭开封口膜,在培养瓶里炼苗34d。炼苗后将小苗取出,洗净苗上附着的培养基,移栽至含基质的营养钵中,注意保持营养钵内基质的湿度。由再生芽诱导生根的培养苗,在生根培养基上的根长到56 cm、苗高34 cm时(约3040 d) ,将培养瓶移至自然温度下揭开封口膜,在培养瓶里炼苗37 d。炼苗后将小苗取出,洗净苗上附着的

13、培养基,移栽至含基质的营养钵中,注意保持营养钵内基质的湿度 6.悬浮细胞培养方法建立细胞悬浮系的愈伤组织为实验室继代培养4 5 次，细胞悬浮培养条件每个培养瓶装25 mL 培养基(均已高压灭菌) ,在培养箱中120 r/m in, 25 黑暗振荡培养。细胞悬浮培养适宜条件是接种量210 g/瓶, 以B5 为基本培养基, 蔗糖质量浓度为20 30 g/L 。 非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以

14、保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100120 r/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上