转基因与敲除技术ppt课件

1、转基因与敲除技术转基因与敲除技术飞鱼2019-12-5转基因技术1定义与原理常用方法研讨前景与运用定义定义v 转基因技术：将人工分别和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的变化，这一技术称之为转基因技术Transgene technology。转基因技术根本原理转基因技术根本原理 1、 目的基因的获取目的基因的获取 2、 克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建 3 、 外源基因与载体的衔接外源基因与载体的衔接4、 DNA导入受体导入受体 5、 重组体的挑选重组体的挑选 6、 克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要

2、步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因外源基因目的基因外源基因基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因衔接酶衔接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主挑选挑选表型挑选表型挑选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定分子杂交分子杂交目目 录录( (插入失活法插入失活法) )抗药性标志选择抗药性标志选择目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录常用的植物转基因方法常用的植物转基因方法v 遗传转化的方法按其能否需求经过组织培育、再生植株可分成两大类:v 1、需求

3、经过组织培育再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；v 2、不需求经过组织培育，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。常用的动物转基因技术常用的动物转基因技术v 1核显微注射法v 2精子介导的基因转移v 3核移植转基因法v 4体细胞核移植法v 过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，经过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创建后近百年的动植物育种那么是采用人工杂交的方法，进展优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。 因此，转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是经过获得优良基因进展遗传改良。转基因技术开展情况转基因技术开展情况v 一是

4、种类培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的开展，目前全球转基因生物新种类已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养质量和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反响器等第三代产品转变，多基因聚合v 二是产业化运用规模迅速扩展。全球已有25个国家同意了24种转基因作物的商业化运用。转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积迅速增长。 v 三是生态和经济效益非常显著。2019至2019年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美圆，累计减少杀虫剂运用35.9万吨。2019年，全球转基因产品市场价值到达75亿美圆。v 植物：抗虫、抗病、抗除草剂植物培育、改良作物质量富含赖氨

5、酸的玉米v 动物：提高生长速度、消费药物蛋白、器官移植、乳腺生物反响器v 微生物：疫苗v 基因治疗，生物治疗，基因诊断，疾病基因的发现与克隆、遗传病的预防运用运用基因敲除(knock-out)定义方法现状定义定义利用基因同源重组进展基因敲除利用基因同源重组进展基因敲除v 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称根本重组。是最根本的DNA重组方式，经过链的断裂和再衔接，在两个DNA分子同源序列间进展单链或双链片段的交换。v 同源重组需求一些重组蛋白和酶，如Rec A、B、C、D及DNA衔接酶等v 最为广泛vHolliday模型中，同源重组主要模

6、型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 ：v两个同源染色体两个同源染色体DNA陈列整齐陈列整齐v一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应对应的链衔接，构成的链衔接，构成Holliday中间体中间体v经过分支挪动产生异源双链经过分支挪动产生异源双链DNAvHolliday中间体切开并修复，构成两个双链重组中间体切开并修复，构成两个双链重组体体DNA，分别为：，分别为： 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 衔接酶衔接酶53535353535353535353535353533

7、3535335535353Holiday中间体中间体53535353Holiday中间体中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA衔接酶衔接酶 DNA衔接酶衔接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体RNA干扰引起的基因敲除干扰引起的基因敲除利用随机插入突变进展基因敲除利用随机插入突变进展基因敲除v即基因捕获法：v 利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目的细胞基因组中进展随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后经过相应的标志进展挑选获得相应的基因

8、敲除细胞。研讨现状研讨现状v 如今基因敲除技术主要运用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探求阶段。文献讲解文献讲解技术原理：同源重组的基因敲除实验目的：用胚胎干细胞为根底的基因打靶技术方法，构建基因敲除p53的大鼠模型。位于10号染色体上，包括10个外显子，其中启动子外显子2上6.7 kb1.6 kbdark agouti (DA) rat ES-cell genomic DNAPositive selectionnegative selectionPGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是为了减少含有随机目的媒

9、介插入的耐抗生素型ES细胞，以富集正确的目的细胞。构建基因载体DA ES cell电穿孔法培育基中参与抗生素扩增耐抗生素克隆体PCR和Southern blot analysis鉴定中靶细胞obtained 14 p53 gene-targeted DA rat ES-cell clones相差镜检法荧光影像PCRDAc8-p53-1 ES cell79 blastocysts囊胚 显微注射嵌合体pseudo-pregnant female SpragueDawley rats转移Twenty-four live-born pups10 male pups6 female pupscollec

10、ted from E4.5 Fischer 344 (F344) ratsfemale SpragueDawley rats交配over 600 offspringone carried the DA rat ES-cell genomeidentified by the appearance of agouti coat colour产24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被着色，阐明存在DAc8-p53-1。PCR genotyping results showed that this germ line animal did not inherit the gene-targeted p5

11、3 alleleFailure of mouse ES cellschromosomal abnormalities in ES cellsover 65% of the cells were polyploid多倍体DAc8-p53-1 ES cell 染色体组型分析whether germline competency of DAc8-p53-1 rat ES cells could be improved through subcloningAround 10% of the cells formed round and compact coloniesidentified 2 subclones with e