南医生化实验报告4

1、生物化学实验报告一、实验目的1.学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；2.学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法；3.学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；4.正确掌握使用离心机的方法步骤；5.正确掌握使用分光光度计的方法步骤。二、实验原理1.肝糖原的提取与鉴定糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉

2、淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。2. 肝糖原的定量测定糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100g，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖

3、原的含量。三、材料与方法：1.实验材料（1）肝糖原的提取与鉴定样品：1.50g的鸡肝试剂：5%CCl3COOH、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂仪器和器材：离心机、试管、玻璃棒、室温至100恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、微量加样枪和白瓷反应板（2） 肝糖原的定量测定样品：0.15g的鸡肝试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液仪器和器材：室温至100恒温水浴箱、比色皿、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪2.实验流程（1）肝糖原的提取与鉴定用托盘天平称取1.50g的鸡肝，剪碎；加入5%CCl3COOH 1 ml，研

4、磨至乳状；加入5%CCl3COOH 3 ml，研磨成肝匀浆；将肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min）；弃去沉淀，取上清液3ml；滴加3ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟；离心5分钟（4000 r / min）；弃去上清液，往沉淀中滴加1ml蒸馏水；沸水浴2分钟，使沉淀溶解；得糖原溶液1ml，滴加5滴浓HCl；白瓷板孔穴中沸水浴15min，冷却；加碘试剂2滴加糖原溶液2滴加碘试剂2滴滴加5滴50%NaOH溶液；呈色反应得到糖原水解液。取糖原水解液2滴，滴加4滴班氏试剂；沸水浴2min，观察变化。用托盘天平称取0.15g的鸡肝；（2） 肝糖原的定量测定沸水浴15min；冷

5、却，全部转入100ml容量瓶中；加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液；肝糖原的定量测定。 取3支试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0-标准葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液-1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5 混匀后，沸水浴10min，冷却。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。四、结果与讨论：1. 实验结果（1） 肝糖原的提取与鉴定 所获糖原溶液如下图： 经与蒸馏水比较，所获糖原溶液呈乳样光泽。经加碘试剂呈色反应，结果如下图：经检验，糖原溶液与碘试剂混合后呈红棕色，故结论是：鸡肝样品中含有糖原。经班氏试剂与糖原溶液混匀后沸水浴

6、2min，结果如下图：经检验，糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后出现砖红色沉淀。故结论是：鸡肝样品中含有糖原，糖原水解后产生葡萄糖。（2） 肝糖原的定量检测空白管、样品管和标准管比色如下：测定次数空白管标准液样品液100.7930.190200.7940.192300.7940.191各管平均值A62000.7940.191根据公式：肝糖原（g/100g肝组织）=A样品/A标准 0.05100/肝组织重(g)100/10001.11得本组实验：肝糖原=0.89g/100g肝组织 故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为0.89g/100g肝组织。2. 结果分析经查阅资

7、料得：饱食鸡肝的肝糖原含量为：23g/100g肝组织而本组实验测得肝糖原=0.89g/100g肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。3.讨论总结经查阅资料和与搭档讨论得以下注意事项：（1）试剂中有强酸、强碱，如蒽酮试剂是用浓硫酸配制的，具有强腐蚀性，故操作中要注意安全；（2）0.2%蒽酮溶液和30%KOH 1.5ml 应用刻度吸管移取，可减少实验误差，比起使用微量加样枪操作也更安全，避免损毁微量加样枪；（3）比色皿盛装溶液体积不得超过比色皿2/3，防止溶液溢出，腐蚀比色杯架；（4）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则将影响比色；（5）使用离心机前一定要配平，否则会损坏离心机；（6）糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后若出现黑色浑浊，则是因为班氏试剂过量所致；（7）蒽酮试剂必须2倍于被测液；（8）沸水浴时，注意打开方式，避免烫伤；（9）糖原提取并转移到100ml容量瓶中进行样品糖原溶液配制时必须注意仔细定容，以免导致稀释倍数过大，导致实验误差；（10）肝糖原提取