实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析

1、教案首页第_5_次课 授课时间：2007年11月27日11月30日课程名称生物化学与分子生物实验课年级2006专业、层次临床医学本科授课教师许成山职称课 型(大、小)小学时4授课题目（章、节）实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析基本教材或主要参考书自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、实现DNA的体外重组，鉴定Bcl-2重组质粒中的插入片段。2、学会设计构建体外重组DNA分子，根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。大体内容与时间安排，教学方法：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理 10min2、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程（录像） 5m

2、in3、EcoR酶切操作步骤的改动及实验注意事项 5min4、学生做实验 140min教学方法：实验+示教教学重点、难点：重点：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理2、DNA限制性内切酶酶切分析的注意事项难点：DNA限制性内切酶酶切分析的原理教研室审阅意见：教研室主任签名：年 月 日基本内容辅助手段和时间分配一、实验原理（一）EcoR酶切重组质粒Bcl-2的原理：限制性内切酶(RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进

3、行切割。本实验是将实验十制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoR酶切底物。人Bcl-2重组质粒是EcoR单酶切的pBluescriptKS(-)载体与EcoR单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。因此用EcoR酶切则应得到空载pBluescriptKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA (1.9kb) 两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。（二）琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形

4、状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料SYBR Green I结合，在紫外灯下可看到桔红色荧光条带，籍此可分析实验结果。二、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程三、操作步骤（改动）1、第1步改为2人/组，每组加入质粒DNA 10l ，用微量移液器吹打混匀，加盖，稍微离心，37水浴反应1h。2、第2步改为称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液60ml ，置微波炉加热至完全熔化，取出摇匀 。3、第6步DNA存在处应显出桔红色荧光条带改为DNA存在处应显出绿色的荧光条带 。

5、4、取消第7步。四、注意事项1、本实验可先进行酶切反应，酶切过程等时间的间隙灌好琼脂糖凝胶。2、进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇2种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至400l，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。3、RE一定要在低温(20)下贮存，因含50%甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰则表明冰箱温度低于20，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将RE管放在冰盒内，用完后立即放在20，每次取酶尽可能使用新的灭菌tip，避免污染。4、进行大量酶切时

6、，先要确定RE的浓度。一般1U RE于37条件下作用底物DNA 1h以上可切割1g DNA。一般来说，要用23倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。5、酶切基因组DNA是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到DNA片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。6、对多个样品基因组DNA分别酶切电泳摄影，绘制出多个样品的DNA限制性内切酶图谱，即可分析作出基因诊断。10min简图示意图图片5min (录像)5min实验+示教140min 小 结限制性核酸内切酶能特异地识别双链DNA中的碱基序列，通过“切割”双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键使DNA断裂。利用它可方便地按需要对DNA进行“剪切”

7、加工。限制性核酸内切酶单位的定义为：在限定的温度和反应环境中，1小时消化1g DNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，在实际使用时需适当增加增加酶量。现在一般用35单位的酶消化1g NDA；反应时间亦可延长到3小时以上乃至过夜；从而使得酶切反应更为完全。内切酶一般均保存在50%的甘油缓冲液中，但进行酶切反应时，过高的甘油浓度会抑制酶活性。在反应体系中甘油的终末浓度不能高于5%，故酶储存液至少需稀释10倍。通常各种核酸内切酶反应都需要Mg2+和一定的盐浓度及适宜的pH，这就需要提供特定的缓冲液。为方便操作，一般习惯于配制10倍浓度的贮存缓冲液，在临用时按110比例稀释即可。现在各厂家均配售各种与酶相应的缓冲液，如配套使用，效果更佳。本实验中所用的Bcl-2重组质粒总长为4