胸苷激酶系统血管靶向抗肝癌效应的机制

1、胸苷激酶系统血管靶向抗肝癌效应的机制                  作者：李宝金，张超，周玉梅，郝颖，刘晓平，区庆嘉【关键词】  肝肿瘤；KDR启动子；基因治疗;重组腺病毒；胸苷激酶系统；HepG2细胞；裸鼠,Balb/c   【Abstract】 AIM: To explore the therapeutic efficacy and mechanism of HSVtk for targe

2、ting angiogenesis against hepatocellular carcinoma. METHODS: By using pAdeasy system, recombinant adenovirus containing kinase domain receptor (KDR) or cytomegalovirus (CMV) promotercontrolled HSVtk gene (AdKDRtk and AdCMVtk) was constructed. The virus was used to infect KDRexpressed human umbilical

3、 venous endothelial cells (HUVEC) and KDRunexpressed HepG2. Following administration of ganciclovir (GCV), the survival rate of genetransfected HUVEC and HepG2 was evaluated by using MTT method.  Hepatocarcinomas were transplanted in 32 Balb/c mice with HepG2 cells, which were subsequently divi

4、ded into 4 groups: GCV group (), Ad group (II), AdCMVtk group (III) and AdKDRtk group (IV). Then selective administration of recombinant adenovirus or Ad intratumorally was performed in all rats. GCV was given at a dose of 100 mg/(kgd) ip in the following days and for 10 d. Microvessel density (MVD)

5、 of tumor in all the treated animals was checked with the immunohistochemical methods and tumor burden was assessed 10 d before and after the last GCV administration. RESULTS: The pAdeasy system produced a high titer of the recombinant adenovirus (1×1013) pfu/L. When the multiplicity of infecti

6、on (MOI) was 100, with increasing GCV concentration from 0 up to 50 mg/L, the survival rate of AdKDRtktransfected HUVEC and HepG2 decreased from (90.7±4.5)% and (91.8±4.3)% to (28.9±5.7)% and (75.4±2.9)%, respectively (P<0.01), while the survival rate of AdCMVtktransfected HUV

7、EC and HepG2 declined from 100% to (17.6±2.5)% and (23.2±5.7)%, respectively (P>0.05). Compared with group,there was a decrease of tumor weight by (14.7±3.2)% in group III and (23.6±5.6)% in group IV, respectively; and there was a distinct difference between group III and IV (

8、P<0.05). The median MVD was 37.4±8.6，30.6±7.8，27.6±7.1，10.7±4.1 (microvessels/mm2) in group I, II, III and IV, respectively; and there were significent differences between group III and II (P<0.05)，IV and II (P<0.01)，IV and III (P<0.01). CONCLUSION: KDR promoterHSVtk

9、gene may effectually restrain the growth of tumor via targeting angiogenesis of hepatocellular carcinoma with treatment of GCV.   【Keywords】 liver neoplasms; KDR promoter; gene therapy; herpes Simplex virus thymidine kinase; HepG2 cells; Mice, Balb/c   【摘要】 目的：探讨KDR为启动子的HSVtk重组腺病

10、毒对肿瘤血管内皮细胞的特异性杀伤效能及机制. 方法：采用pAdeasy系统，构建受KDR启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSVtk基因的重组腺病毒，体外分别感染人脐静脉血管内皮细胞系（HUVEC）和肝癌细胞系HepG2，并以MTT法检测其细胞增殖情况. 人肝癌皮下移植瘤裸鼠随机分成更昔洛韦组(I)，空载体病毒组(II)，重组腺病毒CMVtk组(III)及重组腺病毒AdKDRtk组(IV). 各治疗组瘤内分别注入重组腺病毒液及空载体病毒液. 重组腺病毒治疗组在病毒给予24 h后分别ip GCV，连续10 d. 对照组，ip GCV. 观察瘤体大小及免疫组化法定量测定肿瘤微血管密度.

11、 结果：病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 感染复数（MOI）为100的条件下， GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDRtk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由(90.7±4.5)%和(91.8±4.3)%分别下降至(28.9±5.7)%和(75.4±2.9)%（P<0.01），而感染含AdCMVtk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率分别下降至(17.6±2.5)%和(23.2±5.7)%（P>0.05）. 体内试验中，与对照组比较，,IV组经治疗后肿瘤的生长均受到了明显的抑制，其抑瘤率分

12、别为(14.7±3.2)%和(23.6±5.6)%（P<0.05）. 组织内的平均血管密度（MVD），组为37.4±8.6，组为30.6±7.8，组为27.6±7.1，IV组为10.7±4.1. 其中，组与组(P<0.05)，IV组与组(P<0.01)，IV组与组(P<0.01)之间比较均有统计学差异. 结论：KDR启动子介导的HSVtk具有特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞的作用.   【关键词】 肝肿瘤；KDR启动子；基因治疗;重组腺病毒；胸苷激酶系统；HepG2细胞；裸鼠，Balb/c

13、0;   0引言   1971年，Folkman提出肿瘤生长和转移依赖于血管，认为阻断肿瘤血管生成可以成为一种抑制肿瘤生长的方法. 原发性肝癌是一种多血管性的肿瘤，因此，抗血管生成对其的治疗有着尤为重要的意义1. 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知最重要的血管形成促进因子，能特异地作用于血管内皮细胞，诱导肿瘤的血管形成. KDR(kinase domain insert containing receptor)是VEGF两种高亲和力的酪氨酸激酶受体之一，是VEGF发挥功能的主要受体

14、，它在正常血管内皮细胞中低表达，而在肿瘤血管内皮细胞中高表达2. 因而KDR是一个具有高度特异性的肿瘤治疗靶点3. 利用KDR启动子在组织中的差异性表达，我们设计由KDR启动子驱动HSVTK基因靶向特异表达于肝癌血管内皮细胞，通过给予GCV可特异地破坏肝癌血管，达到靶向血管治疗肝肿瘤的目的.   1材料和方法   1.1材料限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Takara公司及NEC公司. DMEM、胎牛血清、琼脂糖和Lipofectamine2000转染试剂盒购自Gibco公司. 丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)购自Roche公司. 抗KDR

15、抗体、SABCCy3试剂盒及兔抗小鼠CD31多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司. 质粒pBluescriptKDRtk来自于第二军医大学东方肝胆医院殷正丰教授实验室. 腺病毒系统pAdeasy穿梭质粒ptrack，ptrackCMV及pAdeasy由John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠. 人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical venous endothelial cells，HUVEC）由广州医学院第一附属医院汤庆博士惠赠. 人胚胎肾细胞系HEK293细胞及肝癌细胞系HepG2由本实验室保存. Balb/c裸鼠购自南方大学动物实验中心.&

16、#160;  1.2方法用Xho/Sal及Xho/Hind两组内切酶分别酶切pBluescriptKDRtk，各得到一KDRtk片段和tk片段. 然后将其中的KDRtk及tk片段，分别以相同克隆位点插入到穿梭载体ptrack及ptrackCMV中，构建成ptrackKDRtk与ptrackCMVtk. 用Pme酶切使穿梭载体ptrackKDRtk和ptrackCMVtk线性化，然后其转化大肠杆菌BJ5183，与其中预先转入的腺病毒载体pAdeasy进行重源重组，分别称为pAdKDRtk和pAdCMVtk. 用线性化(经Pac酶切)重组腺病毒AdKDRtk和AdCMVtk质粒分别转染2

17、93细胞，操作步骤按Lipofectamine2000产品说明书进行. 尔后，收集细胞，反复冻融，遂收集病毒液. 最后，病毒液离心纯化并检测其滴度.   统计学处理： 结果以x±s表示，采用方差分析比较多组间均数差异，两两比较行LSDt检验，以双侧P<0.05为有统计学意义.   2结果   经Xho/Sal，Hind/Xho二组酶切后，各显2条片段，分别为2.2 kb和3.0 kb；1.8 kb和3.0 kb，大小及测序结果与提供资料相符（图1）. 重组pAdKDRtk和pAdCMVtk经Pac酶切，显示的2个片段大小与预期值(4.5 kb和37.0 kb)一致（图2）. 重组腺病毒质粒转染293细胞后荧光显微镜下可见