免疫组化2基本原理ppt课件

1、免疫组织化学技术免疫组织化学技术 抗原抗体特异性）抗原抗体特异性）标记物，原位显示组织标记物，原位显示组织或细胞内抗原的一门技术。或细胞内抗原的一门技术。根据抗体标记物不同：根据抗体标记物不同：酶酶-免疫酶组织化学免疫酶组织化学荧光素荧光素-免疫荧光组化免疫荧光组化胶体金胶体金-免疫胶体金组化免疫胶体金组化高亲和力物质高亲和力物质-亲和免疫组化亲和免疫组化其中，免疫酶组织化学应用广泛其中，免疫酶组织化学应用广泛以其为例，掌握免疫组化基本原理以其为例，掌握免疫组化基本原理免疫酶组化特点：免疫酶组化特点： 信号定位准确信号定位准确 标本可长期保存标本可长期保存 阳性标记与病变关系阳性标记与病变关系

2、 方法简便，易推广方法简便，易推广酶选择标准：酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。好定位。 酶易于纯化，获得纯制品。酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在酶在PH中性液内较稳定。中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。组织中不应存在与底物作用的内源性酶。符合上述条件：符合上述条件： 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-HRP 硷性磷酸酶硷性磷酸酶-AKP 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶

3、-GOD（一辣根过氧化物酶（一辣根过氧化物酶HRPHRP） 分子量分子量4000040000），不会遮），不会遮盖抗原的结合部位盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内穿透力强，易进入细胞内HRP的底物：低浓度的的底物：低浓度的H2O2，供氢体为，供氢体为胺类及酚类化合物。胺类及酚类化合物。 HRP显色反应：显色反应： HRPH2O2 HRPH2O电

4、子供体电子供体氧化型）氧化型） 电子供体电子供体电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。HRP常用的电子供体：常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)棕色棕色氨乙基卡巴唑氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。4-氯氯-1-茶酚茶酚4CN）蓝色，易弥散，不能久保存）蓝色，易弥散，不能久保存3.3，5.5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB) 黄色黄色 （二硷性磷酸酶（二硷性磷酸

5、酶AKPAKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱组织穿透能力较弱 内源性内源性AKPAKP较高较高 左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 AKP底物：底物：AKP常用的底物为常用的底物为-萘酚萘酚AS-B1磷酸盐磷酸盐 偶联试剂：固兰偶联试剂：固兰BB蓝色蓝色 固红固红TR红色红色 （三葡萄糖氧化酶（三葡萄糖氧化酶GODGOD） 底物为葡萄糖，终产物稳底物为葡萄糖，终产物稳定定 体内无内源性体内无内源性GODGOD 分子量大，穿透力较分子量大，穿透力较弱弱 第一节第一节 基基 本本 原原 理理 酶标记抗体法酶标记抗体法Enzayme Labell

6、ed antibody是将酶通过共价键结合在是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。过抗体去寻找相应抗原。 一、酶标记抗体法一、酶标记抗体法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法（一直接法（一直接法原理：原理：HRP标记在特异标记在特异性抗体第一抗体上，性抗体第一抗体上，抗原抗原-抗体抗体 HRP复合复合物物步骤：一步完成步骤：一步完成优点：简便、省时优点：简便、省时 特异性强，非特异染色特异性强，非特异染色轻轻缺陷：敏感性差缺陷：敏感性差 一种标记抗体只能检测一种标记抗体只能检测一种抗原一种抗原组织

7、抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法（二间接法（二间接法原理：原理：HRP标记在第二抗标记在第二抗体上，体上， 抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体二抗体 HRP复合复合物物优点：较直接法敏感性高优点：较直接法敏感性高 一种标记抗体能用于相应一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原多种抗原缺陷：缺陷： 较直接法费时较直接法费时 非特异性染色稍重非特异性染色稍重 步骤：二步法步骤：二步法 制备抗酶抗体制备抗酶抗体 制备制备PAP复合物复合物酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体

8、第三抗体抗酶抗体）第三抗体抗酶抗体）HRP二、酶桥法二、酶桥法原理：原理：HRP标记在抗酶抗标记在抗酶抗体三抗上，体三抗上， 抗原抗原-特特异性抗体异性抗体-第第 二抗二抗体体-第三抗体第三抗体 HRP复合复合物物一抗、三一抗、三抗有何关抗有何关系？系？优点：与酶标记抗体法相比，敏优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高感性高 （酶与三抗通过抗原（酶与三抗通过抗原-抗抗体反应体反应 结合，避免直接标记结合，避免直接标记引起两者活性降低）引起两者活性降低）缺陷：缺陷： 较费时较费时 步骤：四步法步骤：四步法一、一、PAPPAP法法原理：抗原原理：抗原-特异性抗体特异性抗体-第第 二抗体桥抗体）二抗体桥

9、抗体）- PAP PAP复合物复合物组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP三、三、PAP法过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）法过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）原理：与酶桥法原理：与酶桥法相似，不同之处相似，不同之处是将酶与三抗制是将酶与三抗制备成备成PAPPAP复合物。复合物。抗原抗原-特异性特异性抗体抗体-第二抗第二抗体桥抗）体桥抗）-PAPPAP复合物复合物优点：敏感性较高优点：敏感性较高 背景染色较轻背景染色较轻局限：特异性抗体与局限：特异性抗体与PAP必须为必须为同一种属动物同一种属动物 步骤：三步法步骤：三步法APAAP法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物法

10、）法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物法）原理：抗原原理：抗原-特异抗体特异抗体-二抗二抗- APAAP复合物复合物优点：非特异背景较轻，不受内优点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰源性酶的干扰 缺陷：产物易溶于有机溶剂缺陷：产物易溶于有机溶剂步骤：三步法步骤：三步法 组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP四、双四、双PAPPAP法法原理：在原理：在PAP的基的基础上再重复第二础上再重复第二抗体和抗体和PAP复合物复合物抗原抗原-特异性抗特异性抗体体-二抗桥抗）二抗桥抗）-PAP -二抗二抗- PAP复合物复合物步骤：五步法步骤：五步法 优点：敏感性较高优点：敏

11、感性较高缺陷：步骤多，费时缺陷：步骤多，费时 非特异性背景重非特异性背景重Avidin-一种硷性糖蛋白，由四个相一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成同亚基组成Biotin-小分子维生素小分子维生素Avidin和和Biotin具有较高亲和力，比具有较高亲和力，比普通抗原抗体亲和力高百万倍以上普通抗原抗体亲和力高百万倍以上五、亲和免疫组化五、亲和免疫组化组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体HRP生物素生物素亲和素亲和素原理：酶标记原理：酶标记Biotin形成酶形成酶素化素化 Biotin（一（一 ）ABCABC法法 (Avidin -Biotin peroxidase- (Avidin

12、-Biotin peroxidase-Complex method)Complex method) 酶素化酶素化BiotinAvidin- ABC复合物复合物抗原抗原-特异抗体特异抗体- Biotin标记二抗标记二抗- Avidin Biotin HRP 步骤：三步法步骤：三步法优点：敏感性较高优点：敏感性较高 特异性强特异性强 应用范围广应用范围广缺陷：某些脏器存在内源性生物素干缺陷：某些脏器存在内源性生物素干扰扰 Avidin与糖基、纤维组织、核酸与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应及细胞膜中磷脂有非特异反应 （二（二SABC法法Streptavidin biotin Pero

13、xidase Complex） 比较亲和素，链霉亲和素造成比较亲和素，链霉亲和素造成的背景着色浅的背景着色浅 SABC法已代替法已代替ABC法法 （ 三 （ 三 L S A BL S A B 法 （法 （ L a b e l l e d L a b e l l e d Streptavidin Biotin MethodStreptavidin Biotin Method）-又称链霉亲和素又称链霉亲和素- -过氧化物酶法过氧化物酶法SPSP法）法）原理：原理： Biotin标记第二抗体标记第二抗体 HRP标记标记Avidin抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-Biotin标记第二抗体标记第二抗体-

14、Avidin HRP复合物复合物 步骤：三步法步骤：三步法优点：敏感性高优点：敏感性高 特异性强，背景浅淡特异性强，背景浅淡 方法简便方法简便 六、多聚合物酶法六、多聚合物酶法组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚骨架多聚骨架（一（一EposEpos法法Enhanced polymer one-step Enhanced polymer one-step stainingstaining）原理：采用一种具原理：采用一种具有惰性的多聚化合有惰性的多聚化合物作为骨架，将特物作为骨架，将特异性抗体和异性抗体和HRP，同时标记在多聚合同时标记在多聚合物 分 子 上 ， 形 成物 分 子 上 ， 形 成HRP-多聚合物多聚合物-特异性特异性 抗体。抗体。 步骤：一步法步骤：一步法优点：快速，简便，特异性强，优点：快速，简便，特异性强， 敏感性高敏感性高缺陷：商品化种类不全，缺陷：商品化种类不全， 价格昂贵价格昂贵组织抗原组