桑黄胞外多糖对胶原诱导性关节炎大鼠的免疫调节作用

1、842014；Vol48No9上海中医药杂志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，桑黄胞外多糖对胶原诱导性关节炎大鼠的免疫调节作用蔡国云，张李金凤，艳，水冰洁，范永升，丁兴红杭州310053）将60只Wistar大浙江中医药大学基础医学院（浙江【摘要】目的研究桑黄胞外多糖对胶原诱导性关节炎（CIA）模型大鼠的治疗效果，并探讨其治疗机制。方法鼠随机分为空白组，模型组，阳性对照组，桑黄胞外多糖低、中、高剂量组，每组10只，连续给药30天。采用组织容积法测定关节肿胀ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-程度，关节病理切片观察关节组织病理情况，（TNF-）、白介素-1（IL-1）、白介素-17（IL

2、-17）的表达水平。结果与空白组比较，模型组各指标差异均有统计学意义（P005）。与模型组比较，各治疗组均能抑制非致炎足足趾肿IL-1、IL-17的表达（P005）。与阳性药对照比较，胀（P005），桑黄胞外多糖改善关节组织病理情况，显著降低血清中TNF-、IL-1、IL-17的表达及桑黄胞外多糖低剂量组TNF-IL-1的表达差异无统计学意义（P005）。桑黄胞外多高、中剂量组TNF-、IL-1的表达与空白组差异无统计学意义（P005）。结论糖高剂量组血清中TNF-、果，其作用机制可能是通过抑制NF-B信号通路和炎症细胞因子的表达来实现的。【关键词】桑黄胞外多糖；胶原诱导性关节炎；肿瘤坏死因子

3、-；白介素-1；白介素-17【中图分类号】2855【文献标志码】A【文章编号】1007-1334（2014）09-0084-04桑黄胞外多糖对CIA大鼠有一定的治疗效ImmunoregulatoryeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritisratsLIJin-feng，CAIGuo-yun，ZHANGYan，SHUIBing-jie，FANYong-sheng，DINGXing-hongZhejiangChineseMedicalUniversity，HangzhouAbst

4、ract：ObjectiveToexplorethetherapeuticeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritis（CIA）ratsMethodsSixtyWistarratswererandomlydividedinto6groups：blankgroup，modelgroup，controlgroup，3treatmentgroupswithPhellinusigniariusextracellularpolysaccharide，with10ratsineachgro

5、up，andtheratswerecontentiouslyadministratedfor30daysThepawvolumewasmeasuredtodeterminejointswellingdegreeThepathologicalsectionsofanklewereobservedundermicroscopeThelevelsofTNF-，IL-1，IL-17weredeterminedbyELISAesultsThereweresignificantdifferencesintheindexesbetweentheblankgroupandthemodelgroup（P005）

6、Comparedwiththemodelgroup，eachtreatmentgroupcandecreasethepawswellingdegree（P005），improvejointtissuepathologicalsituation，decreasethelevelsofTNF-，IL-1，IL-17significantly（P005）Comparedwiththepositivedruggroup，nosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-，IL-1andIL-17inhighdoseandmediumdosegro

7、ups，andTNF-andIL-1inlowdosegroup（P005）NosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-andIL-1betweenhighdosegroupandblankgroup（P005）ConclusionPhellinusigniariusextracellularpolysaccharidehasatherapeuticeffectonCIArats，anditsmechanismmaybethroughinhibitingtheexpressionofNF-Bpathwayandtheexpressi

8、onofinflammatorycytokinesKeywords：Phellinusigniariusextracellularpolysaccharide；collagen-inducedarthritis；TNF-；IL-1；IL-17A）是一种以类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病，其主要病变特点是由滑膜炎引起的关节软骨和骨质破坏，并最终导致关节畸形。本病是一种常见风湿免疫病，1全世界发病率约为05%1%。目前，非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素等是治疗本病的主要药物，可基金项目浙江省自然科学基金资助项目（LY14H270

9、014）作者简介李金凤，女，硕士生，主要从事微生物与生化药学方面研究工作。通讯作者丁兴红，教授，硕士生导师。E-mail：zmkm1978126com以在一定程度上减轻由炎症引起的疼痛，但也存在明2显的毒副作用，导致患者的依从性差。多糖作为一种有效的免疫调节剂，在治疗近年来，3和预防类风湿关节炎方面取得了积极进展。桑黄是4具有一种珍贵的药用真菌，其主要活性成分为多糖，56可用于治疗自身抗炎等功效，抗肿瘤、保肝护肝、7免疫性关节炎。本研究以胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠为模型，观察桑黄胞外多糖对CIA大鼠足趾肿胀度、血清中肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）、白介素-17（IL-1

10、7）的影响，并探讨桑黄胞外多糖治疗类风湿关节炎的机制，为桑黄多糖临床治疗类风湿关节炎提供理论依据。2014；Vol48No9上海中医药杂志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，851材料与方法11材料111动物6周龄清洁级Wistar雄性大鼠60只，体质量130160g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。112药物与试剂桑黄（Phellinusigniarius），购于美国典型菌种保藏中心ATCC（编号：36121）。卡介苗，无锡上海生物制品研究所（批号：200703001）；石蜡油，江苏永海硕生物有限公司（批号：20101123）；羊毛脂

11、，华精细化学品有限公司（批号：20110305）；BovineTypeChondrex（批号：20022）；塞来昔布，辉瑞制Collagen，IL-1、IL-药有限公司（批号：BK12CCEK107）；TNF-、17试剂盒，联科生物技术有限公司。113仪器电子天平（BS124S），赛多利斯科学仪器Sanyo；冷冻恒温振有限公司；高压灭菌锅（MLS-3750），D），荡器（DHZ-太仓市实验设备厂；酶标仪（MK3），ThermoMultiskan；振荡器（QB8002），Qilinbeier；涡旋混Qilinbeier；离心机（LX200），Qilinbeier；足合器（KB3），趾容积测量仪（

12、YLS-7B），安合盟（天津）科技有限公司。12药物制备将桑黄（Phellinusigniarius）菌种22、160r/min培养710天。按参考文献8方法，抽滤获得不含菌丝体发酵液，减压浓缩至1/5，加入4倍体积的无水乙醇使其终浓度为80%，4沉淀多糖8h，过滤沉淀洗涤，干燥得到桑黄胞外多糖。配制桑黄胞外多糖溶液，浓度分别为低（100g/g）、中（200g/g）、高（400g/g）。塞来昔布剂量为263g/g。13分组、造模及给药将60只Wistar雄性大鼠随机分为空白组，模型组，阳性对照组，桑黄胞外多糖低、中、高剂量组，每组10只。取20ml液体石蜡与10ml羊毛脂，加热、超声，使121

13、高压其混合均匀，制成弗氏不完全佐剂（IFA），4冰箱保存备用。取5mlIFA，灭菌60min，加入卡介苗，使其终浓度为5g/L。研磨均匀制成弗氏完全佐剂（CFA），加入等体积的BovineTypeCollagen（005mol/L醋酸溶解），制成牛C-冰浴研磨均匀，CFA乳剂。除空白组外，其余各组均在大鼠的右后足CFA乳剂致趾皮下和尾根部各注射01ml的牛C-7天后在大鼠尾根部注射01ml加强免疫，炎，空白组2则在相应的部位注射等量的09%NaCl溶液。模型组灌造模后第15天开始灌胃给药：空白组、胃09%NaCl溶液，阳性对照组灌胃塞来昔布263g/g，桑黄胞外多糖低、中、高剂量组分别灌胃相应

14、的剂量的桑黄胞外多糖溶液。每只大鼠每天灌胃1次，每次2ml，连续给药30天。14取材及指标检测141大鼠形态观察采用关节指数评分法9（0分1分表示个别足趾发红、2分表示肿胀，表示无关节炎，3分表示踝关节及以下肿胀，大部分足趾及足底肿胀，4分表示肿胀累及踝关节以上且不能负重，四肢关节最高得分为16分，大于4分认为关节炎症诱导成功）评价CIA大鼠造模成功与否。142大鼠关节病理给药30天后，将大鼠麻醉处死，截取大鼠非致炎足左后肢，做关节病理切片（HE染色），显微镜观察大鼠的关节组织病理情况。143大鼠关节肿胀程度给药前1天采用足趾容积测量法测定大鼠足趾肿胀容积，给药后每隔4天测定一次。通过各组大鼠

15、的足趾容积的差异来评价各给药组的治疗效果。144大鼠血清细胞因子含量给药30天后，将大3000r/min离鼠麻醉，腹主动脉取血，静置30min后，ELISA法测定TNF-IL-1、心10min，取上层血清，、IL-17含量。15统计学方法采用SPSS190统计软件进行统计学分析。计量资料以s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。以P005为差异有统计学意义。2结果21大鼠形态观察除空白组外，各组大鼠造模第1天右后足出现原发性肿胀，第14天出现继发性肿胀。造模后大鼠右后足关节肿胀明显，并逐渐累及左后足及前肢关节，严重时双后足不能负重，饮食及活动减少，体质量增长较慢，毛色无光泽，关节评分均大于4分

16、，确定造模成功。22大鼠关节组织的病理观察空白组大鼠踝关节滑膜细胞一般为13层，排列致密有序。模型组大鼠踝关节滑膜细胞明显增多，且出现大量的炎症细胞浸润，有血管翳生成，与关节软骨组织粘连，造成软骨侵蚀和破坏，表明造模成功。阳性对照组中，滑膜与软骨粘连情况明显减轻，且侵入软骨腔的滑膜逐渐退出，滑膜细胞增生和炎症浸润也有所减少。桑黄胞外多糖低剂量组滑膜与软骨粘连比较严重，中剂量组中粘连情况有所减轻但软骨表面仍不光滑，高剂量组的病变情况较模型组和低、中剂量组明显减轻，滑膜细胞数量和血管翳较模型组减少，软骨的侵蚀和破坏程度也有所减轻，且软骨表面较光滑。见图1。23对CIA大鼠关节肿胀程度的影响开始给药

17、后824天期间各给大鼠左后足足趾肿胀程度开始降低，药组与模型组差异具有统计学意义（P005）。阳性对照组抑制效果最为明显，在820天期间与胞外多糖低、中、高剂量组差异均具有统计学意义（P005）。桑黄胞外多糖低、中、高剂量组抑制大鼠足趾肿胀程度差异无统计学意义（P005）。第24天桑黄胞外多糖高、中剂量组与阳性对照组足趾肿胀程度差异无统计学意义（P005），而桑黄胞外多糖低剂量组与阳性对照组差异有统计学意义（P005）。第28天各给药组与空白组比较，差异无统计学意义（P005）。见表1。862014；Vol48No9上海中医药杂志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，注：A空白组；B模型

18、组；C阳性对照组；D胞外多糖低剂量组；E胞外多糖中剂量组；F胞外多糖高剂量组表1200)图1大鼠关节病理组织观察(HE，s，ml)各组CIA大鼠足趾肿胀程度比较(n=10组别空白组模型组阳性对照组0d1086070120020176*19260153*20080270*19790180*19150100*16d1162006116540087*12740086*14760134*14000055*13940065*#4d1074009219750234*18040125*19240246*18280112*18180084*20d1190007514380078*12210063#136600

19、93*13080094*12980068*#8d1070007518170126*15160083*16920228*16670101*16640133*24d1191005513750041*11860049#12990096*12410088#12390038#12d1102003316950103*13200121*15800182*14690068*14600091*28d1221013013180082*11550073#12220108#12130083#12080047#桑黄胞外多糖低剂量组桑黄胞外多糖中剂量组桑黄胞外多糖高剂量组组别空白组模型组阳性对照组桑黄胞外多糖低剂量组桑黄

20、胞外多糖中剂量组桑黄胞外多糖高剂量组*P005；与模型组同期比较，#P005；与阳性对照组同期比较，注：与空白组同期比较，P00524对大鼠血清中细胞因子的影响与空白组比较，IL-1、IL-17含量显著升高，模型组大鼠血清中TNF-、差异有统计学意义（P005）。与模型组比较，阳性对照组和桑黄胞外多糖高、中、低剂量组大鼠血清中TNF-IL-1、IL-17含量降低，、差异均有统计学意义（P005）。桑黄胞外多糖各剂量组血清中TNF-含量与阳性对照组相比差异均无统计学意义（P005），且桑黄胞外多糖高剂量组与空白组差异无统计学意义n=10，ng/L)表2各组大鼠血清细胞因子含量比较(s，组别空白组

21、模型组阳性对照组桑黄胞外多糖低剂量组桑黄胞外多糖中剂量组桑黄胞外多糖高剂量组TNF-32162133807114*3544257*3597197*3585260*#（P005）。桑黄胞外多糖各剂量组血清中IL-1含量与阳性对照组差异无统计学意义（P005）。桑黄胞外多糖高、中剂量组血清中IL-17含量与阳性对照组差异无统计学意义（P005）。与桑黄胞外多糖低剂量组IL-1含量差异比较，桑黄胞外多糖高剂量组TNF-、有统计学意义（P005）。与桑黄胞外多糖中剂量组比较，桑黄胞外多糖高剂量组TNF-含量差异有统计学意义（P005）。见表2。IL-157292556840286*5782282#60

22、04323*5795221#5633234#IL-1734151624012315*3546256#3736141*3676139*3597139*#3370254#*P005；与模型组比较，#P005；与阳性对照组比较，P005；与胞外多糖低剂量组比较，P005；与胞外多糖中剂量组注：与空白组比较，比较，P0052014；Vol48No9上海中医药杂志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，873讨论类风湿关节炎患者血清中多种细胞因子关系密IL-1等基因的转录水平，通路，降低TNF-、并通过抑IL-1、IL-17细胞因子的表达，制TNF-、降低Th细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的免疫应答，起

23、到治疗类风湿关节炎的作用。本研究表明，桑黄胞外多糖对胶原诱导的关节炎有一定的治疗效果，为临床治疗类风湿关节炎提供了一定的理论依据。参考文献：左晓霞，1EdwardD，HarrisJr凯利风湿病学M陶立坚，高洁生，2006：853-877译北京：人民卫生出版社，2谷恒存，丁兴红，马哲龙，等蕲蛇水提液对佐剂性关节炎大鼠的免中华中医药杂志，2012，27（10）：2676-2678疫调节作用JJ中国3陈燕，李世刚中药多糖防治类风湿性关节炎的研究进展2011，17（1）：202-204实验方剂学杂志，中国食用菌，2012，134张林芳，邹莉桑黄多糖的研究进展J（4）：1-45WeiD，LiN，LuWD

24、，etalTumor-inhibitoryandliver-protectiveeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharidesJWorldJMicrobiolBiotechnol，2009，25（4）：633-6386JangBS，KimJC，BaeJS，etalExtractsofPhellinusgilvusandPhellinusbaumiiinhibitpulmonaryinflammationinducedbylipopolysaccharideinratsJBiotechnolLett，2004，26（1）：31-33

25、7DaiYC，ZhouLW，CuiBK，etalCurrentadvancesinPhellinussensulato：medicinalspecies，functions，metabolitesandmechanismsJApplMicrobiolBiotechnol，2010，87（5）：1587-15938樊锦艳，王秋颖，薛梅，等桑黄胞外多糖生产培养基的初步研究J食品科技，2004（2）：93-959张宏民云南白药对大鼠实验性类风湿关节炎干预性研究D2013昆明：昆明医科大学，10高自立，董秋梅，王滨，等蒙药忠伦阿汤对胶原诱导性关节炎大鼠中医杂志，2012，53（7）：599-602血清

26、炎性细胞因子的影响J11KimGY，KimSH，HwangSY，etalOraladministrationofproteoglycanisolatedfromPhellinuslinteusinthepreventionandtreatmentofcollagen-inducedarthritisinmiceJBiolPharmBull，2003，26（6）：823-83112张军芳，蒋飞霞，张宜，等细胞因子与类风湿关节炎的研究进展J现代生物医学进展，2012，12（4）：735-73813母传贤，刘国玲，田华，等川芎嗪对胶原性关节炎大鼠血清IL-1、IL-6、IL-2水平及关节浸液NO、P

27、GE2的影响J中国中西医结合2014，34（2）：214-217杂志，MMP-9、NF-14王秦IL-1、B在大鼠胶原关节炎滑膜细胞中的表达D太原：山西医科大学，2006及相关性研究15梁秀军，翟泽玲，董文娟，等胶原性关节炎大鼠炎性细胞因子的动J中国实验动物学报，2013，21（3）：57-60态观察哈尔16白洪宇大鼠类风湿性关节炎实验模型的建立与评价D2009滨：东北农业大学，17林琳类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及D大连：大连医科大学，2011临床意义18刘伟伟，高永翔，赵静，等青藤碱对类风湿性关节炎Th17的影响J中医临床研究，2014，6（6）：137-139研究进展19丁福秀卡介菌多糖核酸辅助治疗对初始涂阳肺结核患者血清VIP和IL-17的影响J中国实用医药，2012，7（24）：34-36切，构成一个参与类风湿关节炎整个病理过程的网络系统，具有免疫调节作用10。TNF-是类风湿关节炎中重要的致炎细胞因子，能促进细胞因子分泌、表达黏附分子、增殖和