徕卡显微镜惠更斯STED反卷积快速指南

1、徒卡显微镜惠更斯STED反卷积快速指南本文档的目的是给 徐卡STED用户简要介绍了使用与 Leica TCS STED SP8 3倍显微镜获得的图像惠更斯专业解卷积图像。图1 （从左至右）：共焦；受激发射损耗；受激发射损耗反褶积参数编辑器（在图像的缩略图右键点击）图2:概述惠更斯图像参数编辑器。这个窗口可以访问所需的受激发射损耗解卷积图像的所有相关图像参数。导入时，LIF文件，大部分参数都自动从元数据提取（见惠更斯Pro用户指南从SVI更多信息）。采样间隔（XYZT ）:从图片属性获得的值显微镜类型：值从图片属性取数值孔径：数值从图片属性取客观质量：取默认值 好”盖玻片位置：使用专用工具（图示

2、左侧）拍摄方向：对于 DMI显微镜总是向上”针孔间距：不相干的共焦 / STED显微镜镜片浸泡：用油”包埋剂：从下拉菜单中选择合适的媒介。Backproj 。从图片属性获得的值： 针孔激发波长值从图片属性取发光波长值从图片属性取多光子激发：值从图片属性取激发填充因子：从图片属性获得的值；默认值=2,除了 TiSaph受激发射损耗（值=1.2）受激发射损耗耗尽型：从图片属性获得的值STED饱和系数：见下面的更多细节受激发射损耗波长值从图片属性取受激发射损耗免疫力分数：见下面的更多细节受激发射损耗3X:请参阅下面的详细资料受激发射损耗饱和度的因素饱和因素原本是指期限：'sat这是受激发射损

3、耗分辨率公式的一部分:它定义了 STED PSF的全宽半高（FWHM ）,最后STED图像的分辨率。 与门控受 激发射损耗和TCS STED SP8 3X，经典的理解饱和因子（主要依赖于激光强度和所选 择的染料的消耗效率）的实施是由包括关于激励和损耗激光模式（附加信息扩展脉冲 或CW）和门控检测。 在实践中，有两个参数影响 STED的分辨率，因此惠更斯饱和 系数：STED耗尽激光强度和栅极起始数值。请记住，为了简化和整体实用性，被用于受激发射损耗PSF在惠更斯的计算只有一个 理想”染料的I sat值。每默认情况下， 3.3和LAS AF版本后，预测值（来自成像参数）会自动在图像属性中设置并转移

4、到惠 更斯。对。LIF的是在LAS AF的早期版本中获得的文件，饱和度的因素需要在惠更 斯手动输入。饱和系数的值可能需要取决于染料的受激发射损耗效率进一步调整。保持眼睛上的图像分辨率（线剖面测量）的情况下，需要一些额外的改变。 下面，将显 示一个阵列示出了饱和度因子与几种计算出的PSF的fwhm值之间的关系。它应该提供的情况下的基准的实际图像分辨率不同于预测1。图3: 一个数列计算的 PSF汇编（操作窗口 - 理论PSF）具有不同的饱和度因子（SF）呈现增加（但不 是线性的！）全宽半高（FWHM ）值。像素尺寸：15纳米。饱和因子值和现实之间显著的差异可以在反褶积的数据进行分析:?饱和系数太高

5、：计算PSF是比真实的PSF显著较小。这将导致在工件视为不与原 始图像相关联强烈粒状结构。止匕外，噪声可以被误解为信号（箭头，见下文）。在 一般情况下，过小的点扩展函数的预测将会对数据不太明显的影响，但小斑点和纹 理可被误判为结构细节和结果在成像数据的错误解释。图4:对图像质量设置过高的饱和度的因素。箭头表示可能的工件 （噪声放大和过度造粒和结构的反差）。?饱和因数过低：图片会出现令人费解的，几乎不管信噪比选择在STED反卷积向导 （见下文）。降噪可能仍然是可以接受的，但去卷积图像将获得更多的信息与可能的工件生成一个巨大的损失（箭头，见下文）。图5:对图像质量设置得太低饱和度的因素。箭头表示显

6、示哪些可以在原始数据清楚地识别显子结构的丧失斑点。受激发射损耗3X惠更斯居然直接从。LIF文件的图片属性提取正确的值。 不过也有一些事情要考虑。 在 主要的受激发射损耗3D滑块调节光的进入既可以通过 旋涡"，或“3DH甜圈”光束的路 径，这将对横向和轴向分辨率的增加之间的比率产生影响的百分比。因此，计算出的PSF具有相同饱和度的形状根据三维滚动条的位置而变化。横向分辨率不断减小，而轴向分辨率的增加（见例计算的PSF与在图6 30饱和值）。分辨率增加，无论是尺寸，最后在其各向同性分辨率达到了 3D滑块百分比之间的比率 又是依赖于所选择的染料的受激发射损耗效率。图6:在惠更斯编译生成不同

7、的 PSF计算的（操作窗口 - 理论PSF）随着3D STED值，随着光的两条 光路之间的再分配的轴向和横向半高宽之比显著变化。像素尺寸：15纳米40纳米（XY）。确定在3D STED正确的饱和系数的最简单的方法在于获得一个额外的控制图像和0%STED 3D和调整惠更斯饱和因素对测量 FWHM。相同的饱和度因子然后可以只要同 一 STED激光强度和栅极启动值被使用用于所有三维 STED滑块的位置。受激发射损耗免疫力分数免疫分数”的惠更斯定义是由荧光基团，它们是免疫的受激发射损耗消耗的激光，并且可以被描述为被添加到纯 STED PSF 一个附加的共焦聚碉组分的人口给出。图7:两个受激发射损耗的

8、PSF比较。在左边的 纯”受激发射损耗PSF可以看出，与设置为0%的免疫力分数。 在 右边用15%的免疫微分产生的相同的 PSF。像素尺寸为15纳米。这里，免疫分数是一个宽泛的定义，旨在覆盖三个不同的受激发射损耗的影响：1 .反斯托克斯激励与受激发射损耗损耗激光：在某些情况下，受激发射损耗耗尽激光也可以激发染料。这始终是依赖于染料/激光组合。徒卡的推荐染料/激光组合通常有没有只非常少的反斯托克斯激励，但在 某些情况下（多色实验），可能有必要使用染料在光谱上位于更靠近STED耗尽激光。对于去卷积的PSF足迹的额外的增加可以通过增加免疫分数来模拟。注意,受激发射损耗消耗激光器具有不同 PSF的形状

9、（面包圈），以有一个固定的激发 激光（点），这是没有考虑到在免疫分数的计算。2 .短寿命成分在 STED CW 和门控STED:CW受激发射损耗损耗增加荧光寿命到受激发射损耗 PSF ,这偏见分辨率朝发射较 长的寿命一个显著的贡献。 短暂的荧光，而另一方面，有受激发射损耗低效率和较 差的分辨率。荧光信号总是由不同生命周期的组件， 所有在最后的STED CW PSF 加起来的整个范围。 因此，短寿命荧光是 免疫”的受激发射损耗光，这会导致类似 的PSF对那些出现在图7B中。在检测该底座将是不太突出的多门使用。作为一 个经验法则，STED CW使用高达10%的免疫分数，而门控STED图像是在3%至

10、 5%的范围内。3 .可怜的损耗效率脉冲受激发射损耗：在大多数情况下，脉冲受激发射损耗的解决方案为您提供了 STED PSF的清洁形 式。然而，由于同步问题，本征染料光物理学和宽度 STED激光脉冲，染料的人 口可能不被有效地耗尽，并且每个定义免疫耗竭激光。总体而言，免疫微分具有只在去卷积的图像的质量几乎没有影响。在情况下，真正的受激发射损耗PSF底座是相当广泛的（强反斯托克斯激发和STED CW）调整计算PSF 的免疫力分数到适当的水平可能使较低的背景阈值水平。另一方面较低的背景估计的增加的信息可以提取/从原始图像增强的量。在理论PSF免疫力分数非常低的水平会使该算法忽略了真实的 PSF ,

11、这可以通过软件 作为一个真正的信号最终被误判的基座，并会最终导致文物，像小边强的信号放大结 构图像。结论匹配计算，理论PSF,以真正的”一罐需要几分钟的尝试。 但是，一旦确定，有类似 的设置实验之间的差异在 PSF形状是微乎其微的。止匕外，随着越来越多的经验，这些 调整变得随着时间的推移更加容易。有在惠更斯的工具，可以帮助点扩展函数的FWHM值，这是在反褶积有帮助的估计。在“FWHM PSF古计”所在的 分析”一节中给定的图像与单一的PSF可见的自动生成的FWHM估计。这可以用来猜测为显微镜的任一对非常小的荧光珠（35纳米）或者甚 至在小的结构，或者在实际样品内的荧光背景的分辨率的近似值。这些

12、值可以被用来调整所计算PSF的图像参数。一个更优雅，也更先进的解决方案是由 “PSFI微器向导”的反褶积”一节中找到提供。此处的实际的PSF被测量并转换成一个数学模型。 用蒸储水PSF解卷积的数据 最终会得到最好的结果，因为它考虑到了系统特定的缺陷和不对称。涤纶短纤蒸储器需要具有非常好的信号-噪声水平的图像正确地提取所需的信息。解卷积精灵（图片缩略图右键点击）所有图片属性现在可以正确地设置，接下来的步骤包括使用反卷积向导的最后的图像 处理。在此步骤中，用户是通过一系列的步骤，这将定义卷积参数并最终执行反卷积 引导。的SVI （网站上的部分-的去卷积步骤和图像处理工具，在惠更斯软件的完整描 述可

13、以的“手册下载”中的 专业用户指南”中找到）。在这个快速指南只有最相关的步 骤将包括生成高质量的图像和避免最常见的器物。选择一个PSF /负载卷积模板图8:加载卷积模板和文件的特殊专业服务公司。在这个步骤中，用户被要求加载之前保存的卷积模板并导入先前计算，或蒸储水PSF表示。如果没有值或引用本节被加载后，软件会使用去卷积的图像作为参考图像参数（参见参数编辑器以上）自动生成计算 PSF。请注意，反褶积精灵还提供了扩展的帮 助文件（参见图8, 9, 10和12的黄色文本框），并直接链接到 SVI网页。为了快速 卷积实验，这一步可以忽略不计。裁剪工具图9:裁剪图像，以减少数据量，提高卷积速度。在这第

14、二步骤中，用户被给予机会来移除图像的空的区域，以提供更有效和更快的去 卷积处理。自动裁剪”选项将自动生成建议裁剪边界，这进一步增加了易用性。直方图工具和背景估计图10:剪切明亮的信号和背景估计是反褶积至关重要的参数。检查图像的直方图和定义背景水平是至关重要的结果的质量。在直方图检查软件警告说，非常明亮的图像包含的区域，其中像素的强度达到最大值（在8位图像，255）的用户。在这些 饱和”的区域由强度分布图中给出的结构信息丢失（削波），这将导致 伪像的产生。对于受激发射损耗数据是很难通过图像重建恢复裁剪区域的丢失的信息， 因此要避免削波是很重要的。背景估计阶段，用户可以设置一个相对的或绝对的背景值

15、。如果背景被设置得太低，则软件可能解释更高的背景水平和噪声的信号错误地放大它们。如果背景电平设置过高，真实的信号可以被忽略和压制，这可能导致信息丢失。图11 :反卷积的图像与不同背景的绝对电平设置（原始图像，背景=0；背景=15;背景=30）。不同的背景值显示不准确的估计的影响。 在过低的水平（0）的噪声被解释为信号而导致强伪影的产生，而高背景估计（30）,使结构信息丢失。自动估计值可以用两种不同的算法来完成。最低艘索图像为平坦区域具有最低的像素 值，而 中/附近的对象”搜索对象，并确定在这些对象中的直接靠近的背景。因此，最低”的算法一般会产生较低的背景水平比中/近对象”。如果需要的话，还有一

16、个选项，它允许用户在 手动”模式设置为自定义值。解卷积阶段图12 :设置反褶积参数。?最大迭代次数：在惠更斯默认CMLE算法，在许多其他反卷积解决方案的理想形象的评价是做了几个迭代。更多的反复测试，更好的图像将被反卷积。 在反褶积强度 何以其特征对 比度增强，并与原始图像相比增加了分辨率。 与过高的信噪比设置组合使用过多的 迭代可能导致伪影的产生。预设的迭代次数被设置为40,用于共焦和受激发射损 耗的图像。?信号噪声比（SNR）:信号-噪声比设置控制许多次迭代之后可达到的最大分辨率，因此，有对对象的 清晰度的影响。图13:反卷积的图像用不同的信号 -噪声电平设置（原始图像， SNR = 2;

17、SNR = 12 , SNR = 40 ）。SNR 值对对象的锐度的效果。 以低水平（2）的结构似乎比在原始图像稍大。 具有高SNR值（40）中的对象变 得过分尖锐。 在这里，没有结构消失数值越高，不像在图 11。找到正确的SNR值有时是困难的。 标准值的10和15之间受激发射损耗范围内，但最好是检查这些值真正适合。为此，线轮廓可以在整个图像被创建（点击并拖动图像上），以便估计在不同强度和本底水平。对于信噪比估计，建议使用类似的背景值在背景估计步骤中输入的那些。默认信噪比被设置为7,用于STED图像和20,用于共焦图象。?质量阈值：测量迭代之间的品质指标之差，并作为一个停止条件。如果质量指数显示迭代之间没有显著的变化，去卷积过程停止。这个值可以被使用，以避免不必要的重复。默认设置为0.05?迭代模式:明智的做法是保持这个在 优化”。欲了解更多详情，请参阅本SVI用户指南。? 砖布局：明智的做法是保持这个在 自动欲了解更多详情，请参阅本SVI用户指南。整理步骤图14:经过去卷积过程完成，该软件提供给检查去卷积的图像，然后重新启动过程，如果需要的可能性。在这些最后的步骤中，用户有机会检查所处理的图像，并将其与原来的比较。如果有必要，去卷积过程可以重新开始使用不同的参数和所有的图片可终于出口