对虾白斑综合症病毒与黄头病毒双重快速检测试纸条

1、对虾白斑综合症病毒与黄头病毒双重快速检测试纸条摘要：双重检测白斑综合症病毒(WSSV)和黄头病毒(YHV)试纸条是建立于特定地对WSSV包膜蛋白VP28(W1和W30)和YHV核壳体蛋白p20(Y19和Y21)的使用单克隆抗体(MAbs)上。单克隆抗体W30和Y19与胶体金结合并喷到紧挨玻璃纤维垫的样品小室内。单克隆抗体W1和Y21羊抗鼠免疫球蛋白G(GAM)抗体被分别喷到硝化纤维膜条的位置指定W,Y和C。这些试纸条被干燥存储在一个塑料袋里并放置在塑料盒子中。取对虾的游泳足作为样本，来评估试纸条对WSSV和YHV的检测能力。将游泳足匀浆在100l缓冲液中，并置于试纸条的样品小室中，顺着消化纤维

2、膜条流动，并可以在15分钟内被观察到抗体蛋白复合物。样本中虾被WSSV和(或)YHV感染,病毒蛋白将会结合到胶体金单抗上。这些复合物会被在测试线W和（或）Y上的单抗俘获,造成外观可见的颜色带。任何未结合胶体金单抗的，就会通过W和Y线，被GAM抗体俘获,在C处形成条带。当样本不包含WSSV和YHV蛋白质或含量低于检测下限的病毒蛋白的测试，只能C处观测到条带。灵敏性测试与使用单一单抗斑点印迹试验相对比，500倍的敏感度低于对WSSV的1-step PCR和1000倍的敏感度低于对YHV的RT-PCR。尽管如此低灵敏度,双重检测试纸条在速度、简单的操作和在不需要复杂的设备或专业技能依然具有优势。而且

3、此试纸条能同时检测WSSV和YHV的能力也节约了花销。1. 背景介绍白斑综合征病毒（WSSV）和对虾黄头病病毒（YHV）是对虾商品化养殖中最常见的具有高传染性的病毒。这些病毒已经造成非常严重的经济损失，尤其在泰国，过去十年里它们已经导致了10亿美元的损失(Flegel, 2006)。各种分子方法已经开发来用于这些病毒的诊断，包括对WSSV的PCR分析(Takahashi et al., 1996; Lo et al.,1996; Srisala et al., 2008)；对YHV的RT-PCR分析（Wongteerasupaya et al.,1997; Cowley et al., 200

4、4）；对YHV的qRT-PCR分析（Dhar et al., 2001; Ma et al., 2008）；对WSSV的环介导等温扩增（LAMP）（Jaroenram et al., 2009）和对YHV的RT-LAMP（Mekata et al., 2009)）。这些方法中，PCR和qPCR由于其高的灵敏度和特异性，已用于广泛用于检测和研究。免疫学为基础的同时使用多克隆抗体（PABS）和单克隆抗体（MAbs）的诊断方法，已经开发了用于WSSV检测（Nadala et al., 1997; Nadala and Loh, 2002; Poulos et al., 2001; Anil et a

5、l., 2002; Liu et al., 2002; Chaivisuthangkura et al., 2004, 2010）和YHV的检测（(Nadala et al., 1997; Sithigorngul et al., 2000, 2002）。然而，这些免疫学为基础的技术，只能在实验室由训练有素的人员执行。这些技术的进一步优化令到免疫层析法试纸条发展到可以进行对WSSV的检测（Powell et al., 2006; Sithigorngul et al., 2006）和对YHV的检测（Sithigorngul et al., 2007）。这些试纸条的特性是其简单性和便利性；结果可

6、以迅速地获得，不需要复杂的工具或专业技能。此外，这种方法可用于筛选个别虾或养殖池中的虾样品来确认相对高水平的病毒感染（相比于基于PCR的方法）。且可以方便地用于由养殖户自己监控两种病毒的感染情况。在被用于检测WSSV与YHV的开发的单一检测试纸条中（Sithigorngul et al., 2006, 2007），被用作俘获抗体的多抗作为测试条的测试线的主要组成部分。除了数量上的控制上，多抗在质控上明显地要比单抗要不可靠。在这份报告中，新的针对WSSV的单抗（W1和W30）和针对YHV的单抗（Y21）会替代多抗更加有效地作为试纸条的检测线（Sithigorngul et al., 2006,

7、2007）；并且原本检测两种病毒的两条试纸条会被整合到一条双重检测的试纸条上，以更加方便地使用单一制剂检测两种病毒。2. 材料和方法2.1病毒的准备从泰国中部佛统府挽铃县的农场获得的称重过后1015g的南美白对虾（凡纳滨）对虾自然感染YHV。从泰国南部宋卡和Prajuabkirikhan省的农场获得，1015g并称重的南美白对虾自然感染WSSV。从被感染的虾截取了两游泳足，匀浆并加入100l 0.3M磷酸盐缓冲盐水（2×PBS中，pH值7.2）和0.5ml等分上清液。在实验前，将这些匀浆贮存在70 C。2.2单克隆抗体的准备如前所述，对WSSV包膜蛋白VP28（W1，W30）具有特异

8、性的单抗，是从免疫的小鼠中免疫并重组得到的（Chaivisuthangkura et al., 2004）。而对YHV核壳蛋白P20（Y21）具有特异性的单抗从小鼠免疫后部分纯化后得到的（Sithigorngul et al., 2002）。对YHV p20 具有特异性的Mab（Y19）先前已经描述过了（Sithigorngul et al., 2002）。用杂交瘤-SFM 无血清培养基（Gibco, Carlsbad, CA, USA）培养产生MAbs的杂交瘤，并且按照生产商的说明使用琼脂糖凝胶柱（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN,

9、 USA）纯化MAbs。用磷酸盐缓冲液（PB：10mM磷酸缓冲液，pH7.3）对洗脱的抗体进行透析，并且将抗体浓度调至1mg / ml。2.3斑点印迹试验分别用来自未感染的对虾游泳足匀浆稀释感染了WSSV或YHV的对虾游泳足匀浆，并将稀释液点到硝酸纤维素膜上。如前所述，将硝酸纤维膜置于包含对WSSV或YHV具特异性的单抗溶液中，并且此 单抗能与病毒蛋白结合后能被检测到（Sithigorngul et al., 2002; Chaivisuthangkura et al., 2004）。在使用成对抗体时，任何观察到的测试灵敏性的上升都表明MAbs与非重叠抗原结合。2.4. 免疫层析试纸条的准备双

10、重检测试纸条是从Pacific Biotech Co. Ltd（泰国，碧差汶省）购置的。单抗 W30和Y19需与胶体金颗粒（直径10nm）进行聚合，并以5和3l/cm的规格喷在玻璃纤维垫上，而且在使用前需要在40下干燥保存过夜。单抗W1（0.4mg/ml）和Y 21（1mg/ml）是各自连续地以1和1.5l/cm的规格微喷到硝酸纤维素膜（孔径：8-m）特定地位置。这些特定的位置就是试纸条上的用于检测WSSV的W线和用于检测YHV的Y线（图.1A）。羊抗鼠IgG抗体（0.8mg/ml）以1l/cm的规格喷到相同的硝酸纤维膜上作为质控线C的地方。然后将膜置于40下干燥过夜。组装时，玻璃纤维垫与喷有

11、结合了胶体金的W29和Y19硝酸纤维膜接合时，应在其反面并置于质控线的下游处。样本垫置于玻璃纤维膜前方样本小室处。吸收垫置于在最末端，紧靠着质控线以收集最后多余的待测液（图. 1A）。这些组件被切割成4.5mm宽的试纸条，装于一独立的塑料小盒子中（图.1C），最后贮存在干燥的塑料袋子中。2.5. 特异性检测从未感染或自然感染WSSV或YHV的南美白对虾中取其游泳足（1015g），并在PBS（50l/游泳足）作匀浆处理。然后，此匀浆用1:5的缓冲液（30mM Tris，336mM NaCl，9nM EDTA，1% Triton X-100，pH=9.3）稀释。取其稀释后的上清液100l并置于单独

12、的试纸条的样本小室中，让其像色谱那样，到达吸收垫前，在试纸条的硝酸纤维流动流至W，Y和C处（图.1B）。在15min内即可观察到样本在试纸条上的试验结果。若是阳性，则在W和（或）Y处与C处出现红紫色的条带，而若是阴性则只在C处出现红紫色条带（图.2）。感染了WSSV和YHV的对虾游泳足匀浆液可以以1:1的比例进行同样的的实验。为了确定其特异性，从感染了桃拉综合征病毒（TSV）或皮下及造血组织坏死病病毒（IHHNV）的虾去其游泳足以相同的方法作了实验。以确定两种病毒与单抗结合时可能造成的干扰，在进行试纸条灵敏度检测对比实验前，感染WSSV的对虾游泳足匀浆分别与从感染YHV或未感染的对虾游泳足匀浆

13、进行稀释。相反地，感染YHV的匀浆则与感染WSSV或未感染的对虾游泳足匀浆分别稀释，并以相同的方式进行实验。2.6. 试纸条与斑点印迹试验和PCR的灵敏性对比从感染了WSSV或YHV的南美白对虾游泳足匀浆中取上清液，并分别用未被感染的南美白对虾游泳足匀浆稀释（用斑点印迹试验的PBS或试纸条和PCR的应用缓冲液）。从每个稀释液中取1l作为样品，并像之前描述的单抗对WSSV或YHV特异性测试那样，用斑点印迹试验来试验。用高纯度核酸试剂盒（罗氏分子生物化学试剂）从相同对虾的匀浆中（100l）中提取的，并且用未感染对虾中提取的核酸分别进行稀释。这些样本用于证明其是否含有WSSV 的DNA或YHV的RN

14、A。用引物VP28F和VP28R进行PCR，得到长度为633bp的扩增子（Chaivisuthangkura et al., 2004）证明其含有WSSV的DNA；用设计好的引物YHV10F和YHV114R进行RT-PCR，得到长度为135bp的扩增子（Wongteerasupaya et al.,1997）来证明其含有YHV的RNA。如上所述，相同的稀释核酸样本分装后同样用于试纸条试验。用其他检验灵敏度的方法与其通过琼脂凝胶电泳产生DNA的最低稀释浓度方法来对比。2.7. 热稳定性测试经过干燥处理保存在塑料袋的免疫层析试纸条置于60的烘箱中，在使用前分别存放0,10，20和30天。用混合了感

15、染了WSSV和YHV的南美白对虾游泳足匀浆以1:5和1:100的比例稀释后对试纸条进行试验（每次试验使用5片试纸条）。用未感染南美白对虾游泳足匀浆得到的质控线条带强度与其免疫条带强度作对比。图1：试验试纸条。（A）图中示出双重检测试纸条中各单抗的位置。（B）含有WSSV和YHV的样本到达样本垫后，检测线（W和Y）上的抗体将俘获结合了抗体和抗原的复合物，并在W和Y处显示出红紫色的胶体金条带。而未被结合的抗体则会越过检测线，在C处卑羊抗鼠IgG抗体（GAM）所俘获并出现一条条带。样本的其余成分则被吸收垫所吸收。（C）中图片显示的是打开包装盒测试前的双重检测试纸条。（D）则显示的是包装试纸条的小盒子

16、。黄色的正方形和蓝色三角形代表对虾的组织。（在该图中说明的参考颜色的解释，读者可参考该文章的网页版本。）图2：双重测试试纸条实验结果。对虾游泳足匀浆样本：（A）未感染病毒的对虾；（B）感染了WSSV的对虾；（C）感染了YHV的对虾；（D）将B和C混合。W：检测WSSV的检测线，Y：检测YHV的检测线，C：质控线。3. 结果3.1. 对WSSV和YHV特异性MAbs的生产两组对WSSV 的VP28具有特异性的单抗（W1和W30）是从免疫过的小鼠中得到后并将VP28蛋白（rVP28）重组。这两组结合在VP28不同位置的单抗显示出相同水平地亲和力。这两种单抗的结合使用令到斑点印迹检测灵敏度增加了2倍

17、（图.3A）。相反地，单体W30通过单抗W29结合到到该重叠表位，基于该发现，这两种单抗的结合并未增加斑点印迹试验检测的灵敏度（数据未显示）。因此，如上所述，对于免疫层析试纸条，将与胶体金结合的单抗W30替代单抗W29和W1置于检测线上并替代检测WSSV试纸条上兔抗-rVP28与单抗W28的合用（Sithigorngul et al., 2006）。对YHV p20具有特异性的单抗Y21表现出与单抗Y19相同的检测灵敏度，并且当它们一起使用时，斑点印迹试验的检测灵敏度增加了2倍（图.3B）。如先前报告的描述，为了使其优化，在试纸条的检测线上使用单抗Y21而不使用单一检测YHV试纸条中重组p20

18、的多抗（Sithigorngul et al., 2007）。3.2. 试纸条的优化在生产双重检测试纸条的最后优化中，单抗W30（5l/cm）和单抗Y19（3l/cm）与胶体金颗粒结合，分别喷到每条试纸条的玻璃纤维垫上。对于检测线和质控线，单抗W1（0.4mg/ml），单抗Y21（1mg/ml）和羊抗鼠（0.8mg/ml）以1,1.5和1l/cm的规格分别喷到硝酸纤维膜的W，Y和C处，并且因为这些单抗表现出其对稀释了的感染病毒的对虾样本高度的灵敏性，以致即使是未被感染的对虾样本也不会显示出假阳性。3.3. 试纸条的特异性检验当感染了WSSV或者YHV的对虾样本被用作检测时，只能观察到一条色带在

19、W或Y线上。可以观察到，在两种病毒之间或者其他对虾病毒间，如TSV和IHHNV，并没有出现交叉反应。当使用感染了这两种病毒的对虾样本混合物，在W和Y处都可以观察到条带，而互相之间不发生任何干扰（图.2）。此外，该病毒在病毒混合物的病毒含量比与另一病毒低得多，检测灵敏度仍类似于含有一种病毒匀浆样品的相同效价（图.4）。这个试纸条可以检测在东南亚发现的的强毒株YHV-1a和YHV-1b（Senapin et al., 2010）以及在澳大利亚发现的与鳃相关的病毒（GAV或YHV-2）（Sithigorngul et al., 2007）。图3：对感染了WSSV和YHV的对虾进行的斑点杂交试验结果。

20、感染了WSSV（A）或YHV（B）的南美白对虾游泳足匀浆用未被感染的对虾游泳足匀浆稀释，并且添加到硝酸纤维膜上（1l/点），单抗极限检测值：W1（a），W30（b），W1和W30的组合（c），Y21（d）和Y19和Y21（f）（箭头指的地方）。底下的方形显示的是未被感染的南美白对虾游泳足匀浆检测结果。右侧的数字表示每个样品的稀释数。3.4. 灵敏性测试感染了WSSV的对虾匀浆所能显示出明显的阳性结果的最低比例是1:200（图.5A）。灵敏性与用单一两倍的单抗进行的斑点杂交测试相同，且低于用结合了W1和W30的单抗（1:400）的斑点杂交测试（图.3A）。为了与PCR的灵敏性比较，从相同对虾匀浆

21、中提取得核酸用于斑点杂交测试和试纸条检测。在稀释度10-5时，可以检测到633bp的条带（图.6A）。因此，双重检测试纸条的灵敏度比one-step PCR低500倍。然而，双重检测试纸条在检测WSSV的灵敏性上却比单测试WSSV试纸条明显地灵敏100倍（Sithigorngul et al., 2006）。相反地，感染了YHV对虾游泳足匀浆得到明确的阳性结果的多滴比例是1：800（图.5B）。此灵敏度与用单一单抗进行斑点杂交试验相同，但是只有用Y19和Y21的混合单抗灵敏度的一半（图.3B）。为了将它的灵敏度与用RT-PCR的灵敏度相比较，用RT-PCR对从同一对虾游泳足匀浆分离出的核酸进行

22、试验。在稀释度为10-6的稀释液中，可以检测到135bp的浅带（图.6B）。因此，双重检测试纸条的灵敏度比one-step RT-PCR的低1000倍。3.5. 热稳定性测试在60用游泳足匀浆，在稀释比为1:5进行热稳定性测试，显示免疫反应条带强度在0,10和20天孵育后并无差异。但是30天的孵育期后，其强度有轻微的下降。然而，在1:100稀释液中，可以观察到处理样品中免疫条带的强度并无差异。这结果表明，这试纸条可以在室温下储存至少两年并且可以保持其功能不变（Paek et al., 2000），这跟单一测试WSSV（Sithigorngul et al., 2006）或YHV（Sithigo

23、rngul et al., 2007）的试纸条的保质期一样。图4：同一匀浆的WSSV与YHV干扰性测试。分别用南美白对虾感染了YHV的游泳足匀浆（A）或未感染的（B）稀释感染了WSSV的游泳足匀浆。相反的实验则分别用南美白对虾感染了WSSV的游泳足匀浆（C）或为感染的（D）稀释感染了YHV的游泳足匀浆。它们被加到试纸条上的体积为100l/条。稀释匀浆的稀释度为1:5.并且用于稀释的匀浆稀释比例显示在左侧和右侧。图5：试纸条检测WSSV和YHV灵敏度测试。感染了WSSV或YHV的南美白对虾游泳足匀浆分别用未感染的对虾游泳足匀浆来稀释并且添加到试纸条的体积为100l/条。箭头给出的为极限检测出WS

24、SV（A）和YHV（B）的稀释比例。注意：当使用这样品15分钟后薄膜还是湿润时，能后观察到检测出WSSV为阳性结果的稀释比例为1:200和检测出YHV的为1:800。4. 讨论测检WSSV和YHV的双重免疫层析试纸使用对WSSV具特异性的VP28和对YHV具特异性的p20来研制。实验的检测灵敏度与之前单一检测YHV的试纸条（Sithigorngul et al.,2007）相同，并比之前单一检测WSSV试纸条（Sithigorngul et al., 2006).）的要高。初步实验表明，组合使用3种不同的VP28单抗并将任一置于W检测线上，或者结合了胶体金，都不会增加其对WSSV的检测灵敏度。

25、的确，与单独使用单抗W1对比，将单抗W28用于检测线，检测WSSV的灵敏度有明显的增加。出乎意料的是，加入单抗W28作为胶体金偶连物产生了相同的效果，因为酶联免疫吸附测定和斑点杂交测试的结果都表明三种用在测试的WSSV单抗VP28（W1,W28和W30）都结合在VP28的非重叠抗原表位上。单抗W28引起干扰作用的原因现时还未清楚。但是，有可能的是单抗与胶体金颗粒（10nm）的结合导致了硬脂酸干扰了近端抗原表位的结合。为了解决此问题，只有单抗W1和W30分别被用在检测线上和与胶体金的结合。图6：PCR和RT-PCR检测结果。在图.3和图.4被用来进行斑点杂交试验的感染了WSSV和YHV的南美白对虾游泳足匀浆分别用未感染的对虾匀浆稀释，并且用PCR检测WSSV（A）和用RT-PCR检测YHV（B）。M列：DNA marker；a列：10-3,b列：10-4，c列：10-5，d列：10-6，e列：10-7，f列：10-8，g列：未感染的对虾游泳足匀浆。箭头处：在最低稀释度，633bp和135bp的PCR产物显示出的可观察到的阳性结果。即使双重检测试纸条中WSSV单抗W1使用最佳浓度（0.4mg/ml）比单一检测WSSV试纸条使用抗体浓度（1.5mg/ml）要低，但是其对WSSV的检测灵敏度却高出100倍。此外，检测线上的低浓度单抗W1令其检测WSSV与远离样