定量PCR基本原理及方法ppt课件

1、定量定量PCR基本原理及方法基本原理及方法基因有限公司基因有限公司 黄妤黄妤荧光定量荧光定量PCR基本原理基本原理荧光定量荧光定量PCR标记方法标记方法荧光定量荧光定量PCR不同方法学的应用不同方法学的应用内 容内 容 定量定量PCR技术的产生技术的产生1992年由年由Higuchi等人第一次报告：使用等人第一次报告：使用EB加入加入PCR反应体系，经改装的带有冷反应体系，经改装的带有冷CCD的的PCR仪检测样品的荧光强度仪检测样品的荧光强度核酸核酸 染料荧光染料荧光后来用与双链后来用与双链DNA有更强结合力的有更强结合力的SYBR Green I取代取代EB 荧光定量荧光定量PCR基本原理基

2、本原理Real-time ChemistriesPCR的理论方程：的理论方程：Y=x(1+ Ev)n Y：扩增物数量；：扩增物数量； X ：起始模板数量；：起始模板数量；Ev：扩增效率；：扩增效率；n：扩增循环数扩增循环数1. 终点法定量原理终点法定量原理前提：在最佳实验、循环次数前提：在最佳实验、循环次数n一定、一定、Ev相同相同原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即：原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即：lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY - b (b为常数为常数)2. 实时检测法定量原理实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同前提：在最佳实验、相同Ev以、扩

3、增产物量相同以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数原理：反应物中原始分子数X与其所需要的扩增循环次数与其所需要的扩增循环次数n成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgYnLg(1+Ev)=b - na (a、b为常数为常数) 荧光定量荧光定量PCR的定量原理的定量原理阈值：阈值：PCR扩增信号进入相对稳扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。定的对数增长期时的荧光值。阈值阈值threshold的设定的设定PCR efficiency=10(-1/slope)-1Where slope=1/mSlope -3.322100%

4、efficiencyPCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Ct值值n：扩增循环数：扩增循环数 n: 扩增循环数的确定扩增循环数的确定logN=log N0 +nlogE n=Ct每个模板的每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝值，即可计算出该样品的起

5、始拷贝数。数。 Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系Y轴Ct值X起始拷贝数的对数标准曲线标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度计算待测样品的初始模板浓度log N0 =-Ct logE+logN 绝对定量绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较未知浓度的样品与标准曲线相比较l 内掺式染料内掺式染料 SYBR Green I, LC Greenl 序列特异性探针序列特异性探针 Taqman l Molecular Beaconsl FRETl 引物特异性探针引物特异性探针Amplifluor (Intergen)l LUX 荧

6、光定量荧光定量 PCR 标记方法标记方法5353SGExcitationSGSGSGSGEmission5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionRQ53535353ExcitationRQQRQRExcitationRQExcitationRQQRExcitationEmissionOligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer 荧光定量荧光定量PCR不同方法学的应用不同方法学的应用 研究目的研究目的 标记方法标记方法l 定量分析基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）定量分析基因

7、拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）l Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc 研究目的l 基因型分析基因型分析SNP、突变型分析）、突变型分析）l Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Greenl 熔解曲线分析熔解曲线分析l Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果 （自备标准品，检测样品做复管）l 绝对定量绝对定量某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定

8、量分析，下图为用Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）HouseKeeper GeneGene of Interestl 相对定量相对定量利用溶解曲线进行实验条件的优化RG3000）l 熔解曲线分析熔解曲线分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT.35.3.25.2.15.1.05Bin ABin BAnnealing at 60deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT1.21.11.

9、9.8.7.6.5.4.3.2.10Bin AAnnealing at 63 标记方法标记方法l Taqmanl 定量分析，基因型分析l Sybr-Greenl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析 (LC Green)l Molecular Beaconl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l FRETl 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l Ampliflour Probe，LUXl 定量分析 基因型分析基因型分析l 利用扩增信号的种类来分型利用扩增信号的种类来分型 Taqmanl 根据熔解曲线的不同来分型根据熔解曲线的不同来分型 FRET, Molecular Beaconl LC Gre

10、en双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素Flr标志，而野生型探针则用不同的荧光物Tet标志。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型野生型或突变型的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。l 利用扩增信号的种类来分型利用扩增信号的种类来分型杂合型野生型突变型 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。l 利用熔解曲线检测基因突变利用熔解曲线检测基因突变杂合型野生型突变型利用内掺式染料进行高分辨率熔解曲线HRM分析基因型HRM根据序列长度、GC含量和互补性分析样品，可