细胞凋亡的分子生化

1、华中科技大学同济医学院生物化学系华中科技大学同济医学院生物化学系 2011.102011.10 Kerr教授教授19721972年我和年我和WyllieWyllie在在研究中观察到一种不研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡同于坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落方式，联想到秋日落叶，我们叶，我们 就把它称作就把它称作ApoptosisApoptosisApoptosis是是 apo apo （off off 离去之意）和离去之意）和ptosis ptosis （falling falling 凋落之意）的合成词，描述树叶及凋落之意）的合成词，描述树叶及花瓣散落之意花瓣散落之意一、细胞凋亡的概念细胞

2、凋亡的概念二、细胞凋亡的生理意义细胞凋亡的生理意义三、细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征四、细胞凋亡的激发因素细胞凋亡的激发因素High magnification micrograph showing contraction band necrosis, a special subtype of coagulative necrosis seen in cardiac myocytes. H&E stain. Necrotic leg wound caused by a brown spider bite H1核心颗粒核心颗粒连接区连接区180-200 bp内源性核酸内切酶2+2+ 2+（

3、三）细胞凋亡与细胞坏死（三）细胞凋亡与细胞坏死细胞凋亡的诱发因素细胞凋亡的诱发因素细胞凋亡的抑制因素细胞凋亡的抑制因素Bcl-2蛋白家族成员概况蛋白家族成员概况Bcl-2 Bcl-2 蛋白家族成员的相互作用与细胞凋亡的关系蛋白家族成员的相互作用与细胞凋亡的关系Caspase分组分组按前区域含有的按前区域含有的嗜同性区段嗜同性区段分：分：1.CARD-Caspases：含有含有90-100aa组成的组成的caspase recuitment domain，如：，如：caspase-1, 2,4,5,9,11,12,13。2.DED-Caspases：含有含有75-80aa组成的组成的death

4、effector domain，如：，如：caspase-8,103. 下游下游caspases：前区域小，不含前区域小，不含嗜嗜同性区段，同性区段，如如caspase-3,6,7 最近研究证实，在线粒体的内外膜间腔中含有最近研究证实，在线粒体的内外膜间腔中含有许多涉及细胞凋亡的因子，包括其中特含有的许多涉及细胞凋亡的因子，包括其中特含有的细胞色细胞色素素C C（cytochrome ccytochrome c，CytcCytc），凋亡诱导因子（），凋亡诱导因子（AIFAIF）和第二个线粒体的和第二个线粒体的CaspaseCaspase激活因子激活因子SMACSMAC（second secon

5、d mitochondria-activator of caspasemitochondria-activator of caspase），），以及与胞以及与胞浆内共含有的浆内共含有的Pro-Caspase-2Pro-Caspase-2，3 3，7 7，9 9等。很多内外等。很多内外因素损伤了线粒体膜的完整性，促使线粒体释放出这因素损伤了线粒体膜的完整性，促使线粒体释放出这些凋亡因子，即可诱导细胞凋亡。现已公认细胞内存些凋亡因子，即可诱导细胞凋亡。现已公认细胞内存在有在有死亡受体介导死亡受体介导、内质网内质网和和线粒体线粒体介导介导的三条细胞的三条细胞凋亡途径。凋亡途径。 Fas介导的信号转导

6、途径介导的信号转导途径FasLFasL同靶细胞膜表面同靶细胞膜表面FasFas结合结合FasFas胞浆段内的胞浆段内的死亡结构域死亡结构域（DDDD）结合）结合FasFas结合蛋白结合蛋白FADDFADD（fas associated Protein with DDfas associated Protein with DD）FADDFADD再以其再以其N N端的端的死亡效应子结构域死亡效应子结构域（death effector death effector domaindomain，DEDDED）结合）结合Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8（或（或-10-10），形成诱导死

7、），形成诱导死亡的信号复合体（亡的信号复合体（death inducing signaling complexdeath inducing signaling complex，DISCDISC）（）（Fas-FADD-Pro-Caspase-8Fas-FADD-Pro-Caspase-8（或（或-10-10）Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8（或（或-10-10）自身活化成）自身活化成Caspase-8Caspase-8（或（或10)10)，激活下游的靶激活下游的靶Pro-CaspasesPro-Caspases（包括（包括Pro-Caspase-3Pro-Caspase-3

8、，-6-6，-7-7）Fas Fas 介导的介导的DaxxDaxxJNKJNK途径途径 19971997年年YangYang等发现另一种蛋白质分子，含有等发现另一种蛋白质分子，含有739739个氨基酸残基，其个氨基酸残基，其C C端端115115个氨基酸区段虽不与个氨基酸区段虽不与DDDD同源，但能结合同源，但能结合FasFas的的DD,DD,该分子称为该分子称为DaxxDaxx（Fas Fas death domain associated Proteindeath domain associated Protein），结合），结合FasFas后可后可激活激活JNK/SAPKJNK/SAPK

9、导致细胞凋亡导致细胞凋亡，此途径不受，此途径不受FLIPFLIPL L (Fas(Fas抑制蛋白抑制蛋白) )抑制。抑制。 因此，因此，FasFas介导凋亡有二条分叉途径：一条是介导凋亡有二条分叉途径：一条是可被可被FLIPFLIPL L抑制的途径，另一条是不被抑制的途径，另一条是不被FLIPFLIPL L抑制的抑制的Daxx-JNKDaxx-JNK途径途径 4. Fas4. Fas介导的凋亡信号转导的介导的凋亡信号转导的负性负性调控调控（1 1）FasFas磷酸酶磷酸酶-1-1（Fas-associated phosphatase-1Fas-associated phosphatase-1，

10、FAP-1FAP-1）：结合：结合FasFas的抑制区域（的抑制区域（SDSD），抑制），抑制FasFas诱导的诱导的凋亡。凋亡。（2 2）FasFas抑制蛋白（抑制蛋白（FLIPFLIPL L）：N N端含有端含有2 2个死亡效应子结个死亡效应子结构域（构域（Death effector domain, DEDDeath effector domain, DED），），C C端含有端含有Caspase-8/-10Caspase-8/-10样蛋白酶区，但其活性中心样蛋白酶区，但其活性中心QACRGQACRG中的中的C C换以换以Y Y，无，无CaspasesCaspases样的酶活性。因此样的

11、酶活性。因此FLIPFLIPL L可借其可借其DEDDED竞争结合竞争结合Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8的前区域而阻止其与的前区域而阻止其与FADDFADD结合结合，抑制抑制FasFas介导的凋亡反应。介导的凋亡反应。 其受体当其受体当TNFTNF结合后，诱导结合后，诱导TNF-R1TNF-R1胞浆段的胞浆段的死亡结构域（死亡结构域（DDDD）结合亦含有）结合亦含有DDDD的接头分子肿瘤的接头分子肿瘤坏死因子受体坏死因子受体-1-1结合蛋白（含结合蛋白（含DDDD）（）（TNFR1-TNFR1-associated Protein with DDassociated Pr

12、otein with DD，TRADDTRADD），后者），后者再借其死亡结构域（再借其死亡结构域（DDDD）同步串联结合多种亦含）同步串联结合多种亦含DDDD的下续接头分子，进入多条凋亡途径：的下续接头分子，进入多条凋亡途径： TNF-R1TNF-R1介导的凋亡途径介导的凋亡途径顺序串联结合顺序串联结合RIP RIP 、RAIDDRAIDD、 Procaspase-2 Procaspase-2 ：RIP RIP （Receptor interacting Protein with DDReceptor interacting Protein with DD）：）：其其C C端含有端含有DDD

13、DRAIDD RAIDD （RIP-associated ICH1 Homologous RIP-associated ICH1 Homologous Protein with DD and CARDProtein with DD and CARD）：其）：其N N端含端含CARDCARD，C C端端含含DDDD，其，其CARDCARD结合结合Pro-caspase 2Pro-caspase 2形成诱导死亡的形成诱导死亡的信号复合体（信号复合体（DISCDISC）。）。结合结合FADDFADD（其（其C C端含有端含有DDDD）进入）进入FasFas介导的凋亡介导的凋亡途径。途径。TRADD-

14、RIPTRADD-RIP还可结合还可结合TRAF2:TRAF2: TRAF2 (TRAF2 (TNFR-associated factor 2TNFR-associated factor 2）: :激活激活NIKNIK（NF-B-inducing KinaseNF-B-inducing Kinase）和）和IKK1/2IKK1/2（IKB-Kinase1/2IKB-Kinase1/2），后者再磷酸化并促使），后者再磷酸化并促使IKB/IKB/被泛素化蛋白分解，释放出活性的被泛素化蛋白分解，释放出活性的NF-BNF-B，促进二种凋亡因子促进二种凋亡因子IAPIAP（Inhibitor of ap

15、optosis Inhibitor of apoptosis proteinprotein）和）和IEX-1IEX-1（Immediate-early response Immediate-early response genegene）表达而促进）表达而促进TNF-R1TNF-R1介导的细胞凋亡。介导的细胞凋亡。TRADDTRADD直接顺序串联结合直接顺序串联结合TRAF 2TRAF 2和和CARDIAKCARDIAKCARDIAKCARDIAK： （CARD inducible apoptotic kinase/RIP 2CARD inducible apoptotic kinase/RI

16、P 2），），以其以其C C端的端的CARDCARD结合结合Pro-Caspase1Pro-Caspase1形成形成DISCDISC。FLIPL（large form of FLICE inhibitory protein, caspase-8抑制蛋白）抑制蛋白） FLIP将将Fas介导介导的信号由凋亡的信号由凋亡转变为增殖的转变为增殖的开关作用开关作用性）性）Receptor & Mitochondria Mediated Apoptosis Signaling在线粒体外膜和内膜之间的膜间腔内存在有许在线粒体外膜和内膜之间的膜间腔内存在有许多凋亡因子。在正常时线粒体外膜的通透性一般只

17、允多凋亡因子。在正常时线粒体外膜的通透性一般只允许许5KD5KD的小分子和离子进出，当受某些因素作用破坏的小分子和离子进出，当受某些因素作用破坏了线粒体外膜的这种屏障性通透，引起膜间腔内储存了线粒体外膜的这种屏障性通透，引起膜间腔内储存的凋亡因子释放入胞浆内，立即启动凋亡反应。膜间的凋亡因子释放入胞浆内，立即启动凋亡反应。膜间腔内的凋亡因子有：腔内的凋亡因子有：Cyt.cCyt.c, , 凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（AIFAIF）, , 第二个第二个CaspaseCaspase的线粒体的线粒体激活因子（激活因子（SmacSmac）, , Pro-Pro-caspase-2,-3,-7,-9ca

18、spase-2,-3,-7,-9和和Hsp-10, Hsp-60Hsp-10, Hsp-60等。等。一、线粒体内的凋亡因子一、线粒体内的凋亡因子1 1Cyt.cCyt.c： 由线粒体膜间腔释放入胞浆后，可结合凋亡激由线粒体膜间腔释放入胞浆后，可结合凋亡激活因子活因子-1-1（Apaf-1Apaf-1） 诱导其寡聚化，再募集诱导其寡聚化，再募集Pro-Pro-Caspase-9Caspase-9形成凋亡体（形成凋亡体（ApoptosomeApoptosome），在），在dATP/ATPdATP/ATP参与下参与下Pro-Caspase-9Pro-Caspase-9自身激活形成活性自身激活形成活性

19、的的Caspase-9,Caspase-9,再级联反应激活下游再级联反应激活下游CaspasesCaspases导致细导致细胞凋亡胞凋亡 其进入胞浆内后还可进一步影响线粒体外膜通透其进入胞浆内后还可进一步影响线粒体外膜通透性，故有促进细胞凋亡放大作用。性，故有促进细胞凋亡放大作用。AIFAIF是一种是一种DNADNA内切内切酶，可直接转位入核内催化酶，可直接转位入核内催化DNADNA约约50Kb50Kb的大片段化，的大片段化，与与DNADNA片段化因子片段化因子DFF40DFF40（DNA fragmentation factorDNA fragmentation factor）协同加速）协同

20、加速DNADNA的有序片段化。的有序片段化。2 2凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（AIFAIF） 是分子量为是分子量为10KD10KD和和60KD60KD的二种热休克蛋白分子的二种热休克蛋白分子，它们具有易化激活，它们具有易化激活Pro-CaspasesPro-Caspases的作用，故亦是的作用，故亦是诱导细胞凋亡的因子。诱导细胞凋亡的因子。3 3HSP10/60HSP10/60（Heat shock protein 10/60Heat shock protein 10/60） 第二个第二个CaspaseCaspase的线粒体激活因子的线粒体激活因子 （Second Second Mitocho

21、ndria-derived activator of Caspase, Mitochondria-derived activator of Caspase, SmacSmac） 。以纯二聚体形式自然存在于线粒体膜间。以纯二聚体形式自然存在于线粒体膜间腔内腔内, , 释放入胞浆内可结合凋亡蛋白抑制因子（释放入胞浆内可结合凋亡蛋白抑制因子（Inhibitor of apoptotic proteinInhibitor of apoptotic protein）后进入泛素化）后进入泛素化蛋白分解，故蛋白分解，故SmacSmac是线粒体内的第二个激活是线粒体内的第二个激活CaspaseCaspase的

22、因子的因子4 4SmacSmac二、影响线粒体膜通透性转变的因素二、影响线粒体膜通透性转变的因素（一）、（一）、BcL-2BcL-2族的促凋亡亚族成员族的促凋亡亚族成员1 1BadBad： 在生长因子存在下，可通过磷脂酰肌醇在生长因子存在下，可通过磷脂酰肌醇-3-3-激酶（激酶（phosphatidylinositol-3-kinasephosphatidylinositol-3-kinase，PI-3-KPI-3-K）和）和PKAPKA促使促使BadBad的的SerSer112112，136136磷酸化而抑制其促凋亡活性。磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生长因子时，则在去除生长因子时，则Ba

23、dBad被去磷酸化而与被去磷酸化而与Bcl-2Bcl-2或或Bcl-XBcl-XL L二聚化，破坏线粒体外膜通透性释放出凋亡分二聚化，破坏线粒体外膜通透性释放出凋亡分子而导致细胞凋亡。子而导致细胞凋亡。2 2BidBid： 本来存在于胞浆内，当被本来存在于胞浆内，当被Caspase 8Caspase 8催催化分裂成化分裂成N N端端11kD11kD和和C C端端15kD15kD二个片段，后者即转位二个片段，后者即转位线粒体破坏其外膜通透性而导致凋亡放大作用。线粒体破坏其外膜通透性而导致凋亡放大作用。3.Bim3.Bim： 本是结合在胞浆微管复合体，当受到凋本是结合在胞浆微管复合体，当受到凋亡刺

24、激时转位到线粒体，中和亡刺激时转位到线粒体，中和Bcl-2Bcl-2（或（或Bcl-XBcl-XL L）而导致凋亡。而导致凋亡。 PKC- PKC-与其它的与其它的PKCPKC成员（成员（PKC-PKC-，PKC-PKC-）的功）的功能不同。它一方面可直接作用改变线粒体膜的通透性导致能不同。它一方面可直接作用改变线粒体膜的通透性导致凋亡。另一方面凋亡。另一方面PKC-PKC-是是Caspase 3Caspase 3的靶底物，的靶底物，Caspase3Caspase3可催化可催化PKC-PKC-部分蛋白分解而增强激活，后者磷酸化并分部分蛋白分解而增强激活，后者磷酸化并分解核膜的层连蛋白（解核膜的

25、层连蛋白（LaminLamin）导致核膜破裂。故最近又将）导致核膜破裂。故最近又将PKC-PKC-称为凋亡层连蛋白激酶（称为凋亡层连蛋白激酶（apoptotic lamin apoptotic lamin kinasekinase）。）。 （二）、蛋白激酶（二）、蛋白激酶C-C-（PKC-PKC-）：）： 细胞内钙离子浓度（细胞内钙离子浓度（CaCa2+2+ i i）升高可激活胞浆）升高可激活胞浆内的钙调磷酸酶（内的钙调磷酸酶（CalcineurinCalcineurin），后者促使），后者促使BadBad去去磷酸化激活导致细胞凋亡。磷酸化激活导致细胞凋亡。（三）、（三）、CaCa2+2+ i

26、 i升高：升高： 在线粒体老化时，其呼吸链电子传递受损，在线粒体老化时，其呼吸链电子传递受损，产生活性氧（产生活性氧（reactive oxygen speciesreactive oxygen species，ROSROS）增多，破坏线粒体跨膜压（增多，破坏线粒体跨膜压（mm），增大线粒），增大线粒体膜通透性导致细胞凋亡。体膜通透性导致细胞凋亡。（四）、线粒体老化（四）、线粒体老化一、一、 生理性因子生理性因子（一）（一）p53p53 PTEN PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted phosphatase and tensin homolog

27、 deleted from chromosome 10from chromosome 10）是随）是随P53P53以后呈现最高突变率的以后呈现最高突变率的抑癌基因表达产物，它主要催化抑癌基因表达产物，它主要催化PI-3PI-3，4 4，5-P5-P3 3的肌醇的肌醇3 3位上去磷酸形成位上去磷酸形成PI-4PI-4，5-P5-P2 2，拮抗，拮抗PI-3KinasePI-3KinasePKB/AktPKB/Akt信号通路的抗凋亡作用。因为信号通路的抗凋亡作用。因为PKBPKB具有磷酸化抑具有磷酸化抑制制Caspase 9Caspase 9、BadBad的活性和抑制细胞色素的活性和抑制细胞色素C

28、 C的释放与的释放与FasFas介导的凋亡信号转导，以及通过介导的凋亡信号转导，以及通过FKHRFKHR间接抑制某些凋亡间接抑制某些凋亡因子基因表达等作用，因此具有很强的抗凋亡作用。因子基因表达等作用，因此具有很强的抗凋亡作用。（二（二 ）张力蛋白同源磷酸酯酶（张力蛋白同源磷酸酯酶（PTENPTEN） 现知现知PTENPTEN尚可延长细胞周期而减弱细胞增殖，以尚可延长细胞周期而减弱细胞增殖，以及通过去磷酸化抑制粘着斑激酶（及通过去磷酸化抑制粘着斑激酶（Focal adhesion Focal adhesion kinase,FAKkinase,FAK）而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，故）而抑制肿瘤

29、细胞的转移和侵袭，故PTENPTEN与与P53P53一样均一样均属于一类强效抑瘤因子属于一类强效抑瘤因子，在许多肿瘤组织，在许多肿瘤组织中中PTENPTEN基因是呈现杂合子缺失的。基因是呈现杂合子缺失的。张力蛋白同源磷酸酯酶（张力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）促凋亡机制）促凋亡机制病毒在感染宿主细胞后进行病毒分泌病毒在感染宿主细胞后进行病毒分泌(virocrine), (virocrine), 分泌的病毒因子中有些同源于细胞生长因子、生长因子受分泌的病毒因子中有些同源于细胞生长因子、生长因子受体或信号转导分子，促进宿主细胞增殖和转化，有些是阻体或信号转导分子，促进宿主细胞增殖和转化，有些是阻止宿

30、主细胞的凋亡防御，保护病毒的生存和免被消灭和清止宿主细胞的凋亡防御，保护病毒的生存和免被消灭和清除。除。1 1CrmACrmA（cytokine response modifier Acytokine response modifier A，细胞，细胞因子反应修饰因子因子反应修饰因子A A）。这是牛痘病毒分泌的一种蛋白质。这是牛痘病毒分泌的一种蛋白质因子，分子量因子，分子量38KD38KD，它具有抑制，它具有抑制Caspase3Caspase3和颗粒酶和颗粒酶B B（Granzyme BGranzyme B）活性而起到抗凋亡作用。）活性而起到抗凋亡作用。二、病毒因子二、病毒因子2 2P35:P

31、35:这是由杆状病毒分泌的一种病毒因子，这是由杆状病毒分泌的一种病毒因子，分子量分子量35KD35KD，其分子结构与，其分子结构与BcL-2BcL-2部分同源，故部分同源，故具有抑制凋亡的作用。具有抑制凋亡的作用。3 3EIB55KDEIB55KD和和EIB19KD:EIB19KD:均是腺病毒分泌的病毒因均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分别结合子，二者可分别结合P53P53和和FLASHFLASH而抑制细胞凋亡而抑制细胞凋亡。FLASHFLASH是最近报道的是最近报道的Pro-caspase-8Pro-caspase-8结合结合FADDFADD的的竟争性抑制分子，故有抑制竟争性抑制分子，故有抑制FasFas介导的凋亡作用介导的凋亡作用）。）。4 4HBX:HBX:是乙肝病毒（是乙肝病毒（HBVHBV）分泌的病毒因子，可结）分泌的病毒因子，可结合合P53P53，而抑制凋亡。，而抑制凋亡。5 5E6E6蛋白蛋白: :是人乳头瘤病毒的分泌因子，可促进是人乳头瘤病毒的分泌因子，可促进P53P53分解而抑制凋亡。分解而抑制凋亡。6 6LANA:LANA: 这是肉瘤疱疹病毒在感染潜伏期表达的这是肉瘤疱疹病毒在感染潜伏期表达的一种病毒因子，故特