分子生物学第九章分子生物学研究方法电子教案

1、第九章分子生物学研究方法1课程教学内容(1)核酸技术1基本操作(2)核酸技术2克隆技术(3)核酸技术3测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他(热点)技术2 课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3 课程教学要求本章内容?掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。核酸的凝胶电泳DNA分子的酶切割核酸的分子杂交基因扩增基因的克隆和表达细菌的转化DNA核甘酸序列分析蛋白质的分离与纯化研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一

2、定的速度移向适当的电极。电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这个意义上讲，DNA和RNA勺多核甘酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松

3、散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。Gelmatrix(胶支持物)isaninserted,jello-likeporousmaterialthatsupportsandallowsmacromoleculestomovethrough.Agarose(琼脂糖):(1) amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,(2) butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkbDNAcanbevisualizedbystainingthegelwithfluorescentdyes,suchasethidiumbromid

4、e(EB滨化乙锭)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺)：(1) hashighresolvingcapability,andcanresolveDNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.(2) butcanonlyseparateDNAoveranarrowsizerange(1toafewhundredbp).Pulsed-fieldgelelectrophoresis(脉冲电泳)(1) Theelectricfieldisappliedinpulsesthatareorientedorthogonal

5、ly(直角地)toeachother.(2) SeparateDNAmoleculesaccordingtotheirmoleculeweight,aswellastotheirshapeandtopologicalproperties.(3) CaneffectivelyseparateDNAmoleculesover30-50kbanduptoseveralMbinlength.二、DNA分子的酶切割Restrictionendonucleases(限制性内切酶)cleaveDNAmoleculesatparticularsitesRestrictionendonucleases(RE)a

6、rethenucleasesthatcleaveDNAatparticularsitesbytherecognitionofspecificsequences.REusedinmolecularbiologytypicallyrecognize(识另lj)short(4-8bp)targetsequencesthatareusuallypalindromic(回文结构)，andcut(切害(j)atadefinedsequencewithinthosesequences,e.g.EcoRITherandomoccurrenceofthehexameric(六核苦酸的)sequence:1/40

7、96(4-6=1/46)(1) Restrictionenzymesdifferintherecognitionspecificity:targetsitesaredifferent.(2) Restrictionenzymesdifferinthelengththeyrecognized,andthusthefrequenciesdiffer.(3) RestrictionenzymesdifferinthenatureoftheDNAendstheygenerate:blunt/flushends(平末端),sticky/staggeredends(粘性末端).(4) Restrictio

8、nenzymesdifferinthecleavageactivity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核甘酸序列的单链DNA或RNA当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细血管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去。常用的滤膜有尼龙膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸和二乙氨基乙基纤维素滤膜核酸杂交通常包括两个步骤：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个

9、过程称为核酸印迹转移第二，将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。SouthernBlotting:根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做SouthernDNA印迹技术。NorthernBlotting1979年，J.C.AIwine等人发展出的一种用于RNA杂交的新方法。将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用

10、而使它们永久地结合在一起。称为NorthernBlotting将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白的抗体反应，这种技术叫做WesternBlotting.定义：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。斑点印迹杂交(dotBlotting)：基本原理和操作步骤是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后同Southern印迹一样的方式同核酸探针分子杂交。菌落(噬菌斑)杂交：1975年，Mgrunstein和DHogness根据检测重组体DNA分子的核酸杂交

11、技术原理，对Southern吸引技术做了一些修改，发展出了一种杂交技术。在1977年，W.D.Bemon和R.W.Davis又发展出了与此类似的筛选含有克隆DNA1菌体的杂交技术。菌落杂交或噬菌斑杂交有时也叫做原位杂交，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交。四、基因扩增基因扩增的五个方面的内容：第一，在体外应用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)技术和合成的寡核昔酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。第二，通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上，并转化到适当的寄主细

12、胞，于是在体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。第三，在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因的产生和明显的扩增。第四，程序基因扩增第五，在生物的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关基因在基因组上聚集成簇。聚合酶链式反应：是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家KBMullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR技术的基本原理：首先使双链的DNA分子变性为单链DNA分子然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核甘三磷酸合成新生DNA互补链。DNA聚合酶需要

13、有一小段双链DNA来启动新链的合成。因此新合成的DNA链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡核甘酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。在为每一条链均提供一段寡核甘酸引物的情况下，两条单链都可以作为合成新生互补链的模板。在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新旧链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA合成和链的分离。PCF反应的最后结果是，经过几次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的拷贝数2n.PCF技术的两个特点：第一，能够知道特定DNA序列的合成；第二，特定的DNA区段得到了迅速大

14、量的扩增。例如，经过30次循环，便可使靶DNA得到109倍的扩增。PCF反应及多次重复进行的温度周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤：首先是将含有待扩增DNA羊品的反应混合物放置在高温环境加热1分钟，使双链DNA发生变性，分离出单链的模板DNA然后降低反应温度使专门设计的一对寡核甘酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用，结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，将反应混合物的温度上升到72度左右保温15分钟，这时在DNA聚合酶的作用下，链得到延伸。寡核甘酸引物：引物长度：通常在15-30mers简并引物：是一类由寡核甘酸组成的混合物，彼此仅有一个或几个核甘

15、酸的差异。嵌套引物TaqDNA聚合酶：Klenow片段热敏感，易失活；反应温度低，出现错配碱基；1986年，从75度的热泉中的细菌中分离纯化出Taq酶。与大肠杆菌DNA聚合酶相比，Taq酶使PCR勺特异性和敏感性高PCR技术的应用：基因组克隆、反向PCR和染色体步移、不对称PCR与DNA序列测定、RT-PCR与RNA分析、基因的体外诱变、基因组的比较研究五、基因的克隆和表达Processes（过程）ofDNAcloning:1） ）FormtherecombinantDNAmolecules（重组DNA）byinsertingyourinterestedDNAfragmentsintoapro

16、pervector（载体）.（Fequirerestrictionenzymesandligase）2） Transform（转化）therecombinantDNAmoleculesintocompetentcells（感受态细胞）.3） PropagationofthecellscontainingtherecombinantDNAtoformaclone（克隆）,asetofidenticalcellscontainingthesamerecombinantDNA.4） Selectthedesiredclonesusingtheselectivemarker.5） Hostorgani

17、sms/cells（宿主）:wheretheplasmidsgetmultipliedandpropagatedfaithfully,whichiscrucialforDNAcloning.Prokaryotichost（原核宿主）:E.coli（mostcases）-Eukaryotichost（真核宿主）:YeastSaccharomycescerevisiae（largefragmentsofhumangenome）GeneralfeaturesofaVector（作为载体的一般特征）：1）Theycontainanoriginofreplicationandcanautonomousl

18、yreplicatingDNAindependentofhost'sgenome.2）Easilytobeisolatedfromthehostcell.Mostarecircular,somearelinear（e.g.YACvector）.3）Containsatleastoneselectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.4）Containsamultiplecloningsite（MCS）tobecutbyrestrictionenzymesfo

19、rDNAmanipulation.Cloningvectors（克隆载体）:allowingtheexogenousDNAtobeinserted,stored,andmanipulatedatDNAlevel.E.colicloningvector（circular）:plasmids（质粒）、bacteriophages（IandM13）（噬菌体）、plasmid-bacteriophageIhybrids（cosmids）（考斯质粒质粒和噬菌体杂和体）。Yeastcloningvector:yeastartificialchromosomes（YACs酵母人工染色体）（Linear）。P

20、lasmids:small,extrachromosomalcircularmolecules,from2to-200kbinsize,whichexistinmultiplecopieswithinthehostcells.Containanoriginofreplication（复制起点），atleastoneselectivemarker（选择标记）andmultiplecloningsite（多克隆位点）.Exampleofselectivemarker*:amprgeneencodingtheenzymeb-lactamsewhichdegradespenicillinantibio

21、ticssuchasampicillin.（抗氨芾）Thecommonlyusedplasmidaresmallinsize（3kb）LibrariesofDNAmoleculescanbecreatedbycloning（GenomiclibraryandcDNAlibrary）:ADNAlibrary（DNA文库）isapopulationofidenticalvectorsthateachcontainsadifferentDNAinsert.GenomicLibrary（基因组文库）:theDNAinsertsinaDNAlibraryisderivedfromrestrictiond

22、igestionorphysicalshearingofthegenomicDNA.cDNAlibrary（cDNA文库）:theDNAinsertsinaDNAlibraryisconvertedfromthemRNAsofatissue,acelltypeoranorganism.cDNAstandsfortheDNAcopiedfrommRNA.cDNAlibrarygeneration:ThemRNAsarefirstlyreversetranscriptintocDNA,andthesecDNA,bothfulllengthandpartial,areclonedtomakethec

23、DNAlibrary.Colonyscreening:1 ）Antibioticscreening（抗生素选择）：onlytherecombinantplasmidsgrowontheantibiotic-containingplate.2）Blue-whitescreening（蓝白斑选择）：DNAinsertioninthevectorshutsdowntheLacZgeneexpression,andturnsthecolony（菌落）towhite.3）Colonyhybridizationscreening（菌落杂交筛选）fromalibrary.Analysisofaclone:1

24、）Restrictionmapping:digestionoftheplasmidpreparedfromaclonewithrestrictionenzymestoinvestigateiftheinterestedDNAisinsertedtherecombinantplasmid.2）SequencingtheclonedDNAtoseeiftheinsertedDNAmaintainsthecorrectsequence.六、细菌的转化转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。感受态：处于感受态的细胞，某种蛋白能够同核酸作用的复合形

25、式。大肠杆菌的转化：1）用CaCI2处理大肠杆菌细胞，制备感受态细胞；2）将正在生长的大肠杆菌在。度下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）；3）同加入在转化混合物中的质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的对Dnase抗性的复合物。4）转移到42度下作短暂的热应激，这种复合物便会被细菌吸收；5）在富裕培养基中生长一段时间，再涂布在选择性的培养基中分离转化子。细菌转化效率影响细菌转化效率的因素：DNA浓度、纯度和构型，转化细胞的生理状态及其在CaCI2处理和贮藏之后的成活率，以及转化的环境条件（温度、PH值、离子浓度）。环型的质粒DNA分子进入细胞，能够抗御细胞中固有的核酸酶的

26、作用，而线性的DNA分子，则对自由末端的降解作用是极其敏感的，环型DNAt匕线性的高出10-100倍。对于同样的转化DNA而言，大分子量的转化效率要比小分子量的低一些。以每微克质粒DNA出现的转化子菌落数表示的转化频率。应用与大肠杆菌转化程序相类似的方法，也可以成功地转化各种真核细胞，将酵母用酶处理消化细胞壁之后，就会变成原生质体在具有PEG和CaCI2的转化反应体系中，让酵母原生质体同转化DNA接触，那么由于原生质体在生理上得到恢复并再生出细胞壁后，将其涂布在选择性培养基上便可以鉴定出转座子。七、DNA核甘酸序列分析1、Sanger双脱氧链终止法：利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核甘酸顺序的方法，是由英国科学家Sanger等1977年发明的。其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA乍模板，合成出其互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2',3，.双脱氧核甘三磷酸作底物，使之参入到寡核甘酸链的3，末端，从而终止链的生长。2）Maxam-Gilbert化学修饰法：原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生不同长度的链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，便可根据x光片底版上所显现的相应谱带，直接读出待