生长及凋亡作用的实验研究

1、生长及凋亡作用的实验研究作者：肖柳英，洪?菁，潘竞锵，吕俊华，沈文娟【摘要】 目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24 h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2 ml。荔枝核水提液对小鼠S180，EAC抑瘤实验连续给药10 d。测定肿瘤作用与细胞凋亡表达。结果荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用， Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可见30%含

2、药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。论文论文参考网荔枝核水提物能够明显抑制S180，EAC肿瘤的生长（P0.05），荔枝核提取物对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤其抑瘤率达到30.62%；结论荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC体内、外细胞生长的影响，促进肿瘤细胞的凋亡，从而表现抗肿瘤的作用。 【关键词】 荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡荔枝核为无患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的干燥成熟种子。夏季采摘成熟果实，除去果皮及肉质假种皮，洗净，晒干1。荔枝及荔枝核的

3、经济和药用价值逐渐受到关注,近几年来已有多篇报道用荔枝核中药治疗糖尿病的经验2，荔枝核具有调血脂、保肝以及抗氧化等作用3，4，特别是荔枝核的多糖成分在抗肿瘤、提高机体免疫活性方面具有较大的关注。基于以上的研究，本实验进一步研究荔枝核对荷瘤小鼠体内、外细胞生长及诱导细胞凋亡的影响报道如下。1 材料1.1 动物清洁级 ，新西兰雄性大白兔,购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号：粤监证字2006A001。SPF级小鼠 ，购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号: 粤监证字2006A018。1.2 仪器CO2恒温培养箱（Thermo fora美国）；AIR TECH型医用超净台（苏净

4、集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶标定量测试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 电泳仪（美国）；Eppendorf 低温高速冷冻离心机（德国）。1.3 试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒生药110），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。 环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：05010821。RPIM 1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血

5、清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料 sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)； BAX抗体（cell signaling）； BCL-2抗体（santa cruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce 批号：HI106361 ；丙烯酰胺 sigma ; 甲叉丙烯酰胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸钠sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20

6、 sigma；TRIS-BASE sigma;TRIS sigma ;脱脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN滤纸 whatman。2 方法2.1 实验技术路线2.2 含药血清的制备按李仪奎等5方法制备含药血清：将体重约1.5 kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42 g?kg-1?d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4 g?kg-1?d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每

7、次间隔12 h，灌药前4h禁食不禁水，连续3 d，末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4下静置4 h，3 000 r?min-1离心15 min，无菌分离血清经56，30 min灭活处理后，0.20 m微孔滤膜过滤除菌，置20保存备用。2.3 MTT法检测含药血清对 HepG2细胞的抑制率取对数生长期的细胞HepG2细胞，以3104 ml-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100 l，让细胞贴壁生长24 h后，以不同浓度组含药血清体积比分别为10%，20%，30%作用于细胞，每组浓度设4个复孔，培养72h后分别测细胞的生长抑制率，重复3次取平均值采用,结果见图1;实验结果表明：荔枝

8、核提取物30%含药血清高、中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用。2.4 Hochest33258染色检测细胞凋亡将无菌的铺有多聚赖氨酸盖玻片置于六孔板内，以4105 ml-1细胞接种24 h后， 加入含药血清作用72h后，吸尽培养液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min后，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，边晃动边染色。抗淬灭液封片后，置荧光显微镜下观察，拍片；结果见表1；实验结果表明：其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态。 表1

9、 荔枝核提取物含药血清作用HepG2细胞72h的OD值(略)2.5 流式细胞仪测定凋亡率取对数生长期的HepG2细胞，以4105 ml-1到25 ml玻璃培养瓶，待其贴壁生长24 h后，加药72 h后，胰酶消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用冷PBS洗涤两次，将细胞重悬于70%的冰乙醇固定24 h，离心弃乙醇，PBS洗涤1次，滴加已配好的200l?ml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，离心弃上清液，PBS洗涤1次，加0.5ml碘化丙锭（PI），过夜，离心弃PI，再用PBS洗涤1次，立即上机；结果见图2和表2; 而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3

10、%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。2.6 肿瘤模型的建立2.7 Western blot 方法 检测bcl-2 ,bax含量的表达7按试剂盒说明，提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。12%分离胶： 双蒸水 3.35 ml; 1.5 mol/L Tris ( pH=8.8 ) 2.5 ml; 30%丙烯酰胺 4 ml；10%SDS 0.1 ml；10%过硫酸胺 50 l；TEMED 5 l (临用前加入)；5%浓缩胶： 双蒸水 3.4 ml; 0.5 mol/L Tris ( pH=6.8 ) 0.625 ml；30%丙烯酰胺 0.850 ml；10%SDS 0.05 ml

11、；10%过硫酸胺 50 l；TEMED 5 l (临用前加入)。论文参考网3 结果荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，（见表1），其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。 荔枝核提取物对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑瘤作用，主要是高剂量组表现明显，其抑瘤率达到30.62%；对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。通过Western blot分析，

12、其抑瘤作用主要是通过促进促凋亡蛋白bax的表达，减少抑制凋亡蛋白Bcl 2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，而表现抗肿瘤作用。4 讨论 本实验利用荔枝核对S180，EAC实体瘤经重复3次实验,结果一致，表明荔枝核对S180，EAC实体瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑瘤作用（P0.050.01），结果（见表14），与文献报道一致6。荔枝核“行气散结，祛寒止痛。用于寒疝腹痛，睾丸肿痛”也证实动物体内荔枝核对小鼠S180，肝癌有一定的抑制肿瘤作用6。Purmova等8研究表明，荔枝以及人参、柴胡、大豆、黄芪等皂苷对心脏功能发挥直接作用或有助于治疗相关疾病，如抑制心肌或肝脏脂质过氧化物的形成及影响心肌或肝脏酶

13、的功能，调整血液凝固、降低胆固醇和血糖水平，或刺激免疫系统、推断皂苷是一组有希望防治心脏和系统疾病的天然化合物。荔枝核提取物能改变实验性2型糖尿病（T2DM）伴胰岛素抵抗（IR）模型大鼠血糖、血脂、胰岛素、胰岛素敏感指数（ISI）、?l素、肿瘤坏死因子-（TNF- ）等指标，纠正T2DM伴IR大鼠胰岛素抵抗相关脂肪细胞因子，改善糖、脂代谢紊乱，增强胰岛素敏感性12。徐庆等13检测荔枝核提取物A，B，C，D，E和F（200和100 mg?L-1）对HePG2，2，15细胞HBsAg与HBeAg表达的影响，结果显示，荔枝核提取物A，B，C，D，E和F在200和100 mg?L-1浓度下对HBsAg

14、和HBeAg表达均有抑制作用，其中以E成分作用最强，在200 mg?L-1浓度下，实验第3天对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为50%和20%，实验第9天分别达到90%和84.3%, 证明荔枝核提取物体外有较强的抗乙肝病毒作用。肖柳英等14观察荔枝核对治疗48例慢性乙型肝炎疗效临床研究，用荔枝核治疗6个月，观察肝功能、肝纤维化、B超等指标结果，治疗4周后治疗组乏力、纳差、腹胀、肝区不适等有改善。治疗12周后，ALT，A，TBiL有改善，AST，G有明显的改善，治疗24周后，HA，LN，PC，IV-C有明显的改善，并有降低血脂，胆固醇、甘油三酯的作用。 荔枝核中具有药理活性的主要有效部位是黄酮类化合物和总皂苷。黄酮、异黄酮及皂苷是具有多种生物活性和药理作用的化合物，它们的作用涵盖了清除自由基、抗氧化、抗感染 、抗过敏、抗菌 、抗病毒、抗糖尿病、抗骨质疏松、抗血栓、抗致癌物质、抑制增生、保护肝脏、保护心血管等多个方面，对治疗和预防肿瘤 、衰老、心血管疾病具有重要意义15，16。 综上所述，本实验是利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤