TRIzol法提RNADNA和蛋白质

1、TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物

2、组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用

3、乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。预防RNase污染注意事项：1 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。3 RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取准备

4、试剂：氯仿，异丙醇，75乙醇，无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌

5、细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温（15-30）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-810000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6. 2-810000×g离心15分钟。

6、样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8. 2-810000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500×g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分

7、钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l无RNase的水或0.5SDS,用枪头吸打几次,55-60放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存

8、至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8一星期以上或-5至-20一年以上。3分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10g ,肾3-4g ,骨骼肌和脑组织1-1.5g ,胎盘1-4g ,上皮细胞8-15g ,成纤维细胞5-7g 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底BRNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高B样品匀浆时加的试剂量太少C匀浆样品时

9、未在室温放置5分钟D吸取水相时混入了有机相ERNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70,而保存在了-5至-20C.细胞在用胰酶处理时过度D.溶液或离心管未经RNase去除处理DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液DNA的分离准备试剂：乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH操作步骤:1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8

10、不超过2000×g离心5分钟。2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-82000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-82000×g离心5分钟, 弃上清。4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600l 8mM Na

11、OH，DNA的浓度通常为0.2-0.3g/l 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50g/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1g , 6.5g , 5.8g 。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝

12、和肾3-4g 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3g 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7g 成纤维细胞5-7g应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1g DNA用作模板。2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每g DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES(l) Final pH 1M HEPES(l)8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事

13、项：1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8保存过夜。2DNA沉淀在75%乙醇中2-8可保存几个月。3DNA在8mM NaOH溶液中4可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4或-20长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底B最终得到的DNA沉淀没有完全溶解A260/A280<1.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中B酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70,而保存在了-5至-2

14、0C样品匀浆时使用了高速匀浆仪RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净BDNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底蛋白质的提取准备试剂：异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS操作步骤：1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-812000×g离心10分钟弃上清。2用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-87500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。3真空抽干蛋白质沉

15、淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物2-810000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20保存备用。注意事项：一个月以上或-5至-20一年以上。2用0.1% SDS在2-8透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分 Trizol Trizol试剂是可即用的从动物、植物细胞和组织或微生物中提取总RN

16、A的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol可溶解细胞内含物，同时具有使蛋白变性、抑制RNase活性的作用，保持RNA的完整性。可以从富含多糖、脂肪酸、蛋白质及RNase的样品中获得完整的RNA.经过Trizol试剂处理后的裂解物，仅仅只需加入氯仿混匀，离心后，便分为三种液相：上层水相含有RNA，中层的半固体相含有DNA，下层的有机相含有少量的DNA和大量的蛋白质、多糖、脂肪酸和其它细胞碎片。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA, 一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.6-1.8。 Trizol试剂可用于小量样品（50-100 mg组织、5×106细胞），也可用于大

17、量样品（> 1 g组织或> 107细胞），对人、其它动物、植物和细菌组织都适用，整个操作步骤方便快捷，一个小时内即可完成反应，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于RT-PCR、 Northern Blot、核酸酶保护实验、mRNA分离和体外翻译等。包装清单：Trizol 50ml或者100 ml 说明书 1 份 保存条件：28保存，本试剂自订购之日起一年内有效。 注意事项:1. 所有离心管、枪头及相关溶液都必需无 RNA酶污染。耐高温器物可150烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干。溶液需

18、用灭菌的DEPC水配制：加0.01%(体积比)DEPC至MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。 2.必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。 3.Trizol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触Trizol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。4.需自备氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC水配制），和DEPC水。 使用说明： 1. 细胞裂解或组织匀浆。 a. 贴壁细胞：吸尽培养液，按照每 10平方厘米细胞加入1ml Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解

19、，然后吸至离心管中。 b. 悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1mlTrizol适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，或者用液氮研磨，确保全部裂解。 c. 组织：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内，或者用液氮研磨组织样品。每50mg-80mg组织加入1ml Trizol，匀浆。 2. 室温静置515分钟。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织，Trizol 裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12,000×g， 4 离心10 分钟，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。 3. 按照每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。 5. 12,000×g， 4离心15分钟