基于荧光差异二维电泳技术的临床尿液蛋白质组学研究方法探讨_图

1、382 基 础 研 究 基于荧光差异二维电泳技术的临床尿液蛋白质组学研究方法探讨王玲 1倪兆慧 1牟姗 1严玉澄 1顾乐怡 1李稻 2【 摘要 】 目的 探讨尿液蛋白质组学研究中样本留取、尿样储存、蛋白浓缩、荧光标记以及二 维电泳过程中的关键问题和具体方法,以期为临床开展相关研究奠定方法学基础。 方法 选取尿蛋 白<0.15g/24h 的糖尿病和高血压男性患者,床边留取新鲜尿液。尿液混合后根据是否添加蛋白酶抑 制剂、长期保存温度、蛋白除盐方法和一向固相 P H 梯度等电聚焦胶条的不同,分为 7组,所有样本 都进行了双向电泳分析比较,部分标本进行了荧光差异电泳分析。 结果 从双向电泳结果可

2、以明显 看出加入蛋白酶抑制剂、-80冰箱保存、反复超滤离心所得到的尿液蛋白点数最多;胶条以 11c m, PH4-7和 PH3-1024cm 的非线性胶条比较合适尿液二维电泳分析。通过不同 Cydye 荧光染料标记后,尿 液荧光差异二维电泳(2D-DIGE分析可以得到重复性好、便于临床和实验室开展的结果。 结论 基 于 2D-DIGE 的临床尿液蛋白质组学研究方法具有可行性,采取合适的方法可以得到良好的研究结果。 【 关键词 】蛋白质组学; 尿液; 荧光差异二维电泳; 方法学 中图分类号:R446.6文献标识码:AUrinary proteomic research based on two

3、dimensional fluorescence differential gel electrophoresisWANG Ling1, NI Zhao-hui1, MOU Shan1, YAN Yu-chen1, GU Le-yi1, LI Dao2. 1Renal Division, Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of medicine, Shanghai 200127, China; 2Department of pathophysiology,Shanghai Jiaotong University School

4、of medicine, Shanghai 200025, China【 Abstract 】 Objective To investigate the methods of urine sample collection and storage, concentrating ofprotein, fluorescence labeling and several key problems about two dimensional electrophoresis (2DE for urinaryproteomic research, and to provide the methodolog

5、y for related clinical research. Methods Male patients withdiabetes mellitus, hypertension, and less than 0.15g protein in 24 hour urine were included. Fresh urine sampleswere collected bedside. Urine samples were pooled together and were divided into 7 groups based on with andwithout adding cocktai

6、l protease inhibitors, storage temperature, protein desalting method, and types of immobi-lized pH gradient iso-electric focusing strips. 2-DE was used for comparison and analysis of samples from thegroups. A part of the samples were analyzed by 2D fluorescence differential gel electrophoresis (2D-D

7、IGE.Results From the 2-DE results, the number of protein spots was more in urine samples treated with proteaseinhibitors, stored at -80 and desalted by repeated ultrafiltration. The nonlinear IPG strips with pH 4-7 and24cm long or pH 3-10 and 11cm long were suitable for urine 2DE. Urinary 2D-DIGE co

8、uld provide repeatableresults useful for clinical and laboratory research after labeling the samples with various Cydyes. Conclusion 2D-DIGE may give ideal results of urinary proteomics for clinical research, if appropriate methodology wasadopted.【 Key words】 Proteomics; Urine; Two dimensional fluor

9、escence differential gel electrophoresis (2D-DIGE; Methodology基金项目:仁济医院-基础医学院合作研究项目 编号:PY07008上海浦东新区社会发展局卫生科技项目编号:PW2007D-3作者单位:200127 上海, 1上海交通大学医学院附属仁济医院肾内科 200025上海, 2上海交通大学医学院病理生理教研室 蛋白质组学作为一种新兴、强大的生物医药 研究手段而倍受关注。随着质谱和蛋白质组学技 术的进展,关于疾病生物学标志物的研究已经成 为本世纪研究的热点之一 1,2。在疾病诊断和预后预测中,体液(比如血液、尿液和唾液等可以提 供大量

10、的信息,而且由于体液样本收集便利、检 测耗费低、获得无创等优势,使体液蛋白质组学 开始成为寻找疾病生物学标志物的重要手段 3。383组 1:采样后即刻添加蛋白酶抑制剂(50:1CocktailSet1CalbiochemMerk ,放入 4冰箱短暂保存后进行低温超滤离心(3000g×45min,4,超滤离心使用截留分子质量为 5000的 YM-3超滤离心管(Millipore,Billerica,MA,USA浓缩尿液蛋白, 取离心管内液, 置-80冰箱保存4个月。 进行二维电泳前, 采用丙酮沉淀蛋白除盐 (5:1,-20丙酮过夜, -20丙酮洗涤2次, 低压冻干法去除残余的丙酮 ,

11、沉淀物经蛋白裂解液再溶解后进行一向等电聚焦电泳(PH4-711cm非线性固相PH梯度等电聚焦胶条(IPGStripe,GEhealthcare和SDS-PAGE二向电泳, 电泳结束后采用银染法显色, 比较二维电泳图谱差异。组 2:不加蛋白酶抑制剂,其它方法同组 1。组 3:储藏温度改为 -20放置 4个月,其它同组 1。组 4 :除盐方法为反复超滤离心洗涤的方法(加入去离子水到 15ml,3000g 离心 45min,重复 3 次,液体浓缩 5倍 ,其它同组 1。组5:一向等电聚焦电泳使用的胶条改为PH3-10, 24cm非线性 IPG 胶条(GEhealthcare, 染色 使用考马斯兰染色

12、显色。组 6:方法同组 5,胶条采用 PH4-711cm非 线性IPG胶条(GEhealthcare。组 7:方法同组 5,胶条使用 PH3-1011cm 非 线性 IPG 胶条(GEhealthcare。1.2荧光标记经过预处理的尿样, 用Bradford方法进行蛋白 定量,然后用 1M 的 TrisBase 溶液将尿样 PH 调节 到 8.5左右,每 50ug 蛋白用 400pmol 的 Cydye 染 料冰上标记 30分钟, 不同的尿样分别用 Cy3和Cy5标记,内标用 Cy2进行标记。标记反应用 1ul10mM 的赖氨酸终止, 再将3种标记样本混合进行蛋白二 维 电 泳 。1.3等电聚

13、焦和 SDS -PAGE 电泳将标记好的蛋白样品混合物和等体积的2×裂 解液(1%IPGbuffer,2%DTT,9Murea,4%CHAPS 混合, 200u l 的混合物用于水化和等电聚焦过程 (IPG-phor, GEhealthcare, 一组选用11cm, PH4-7IPG胶条,另一组选用 11cm,PH3-10的 IPG 胶 条(GEhealthcare 。水化和聚焦过程如下:30V ×6h,60V ×6小时,100V ×1h,500V ×1h,1000V ×1h,5000V ×1h,8000V ×6h

14、,等电聚焦结束后, 即刻进行SDS-PAGE电泳 (GEhealthcare垂直电泳 系统。1.4DIGE分析及统计分析使用DeCyder差异分析软件5.01版进行差异表 达点的搜寻, 并且通过胶内差异(differencesin-gel,DIA 和生物学差异分析(Biologicalvaria-tionanalysis,BVA进行差异表达点的统计学分 析,预设差异表达点为 1500,差异倍数设为 2倍。 2结果2.2选用不同胶条对结果的影响尿液与血清等其它体液样本相比,其蛋白构 成相对简单、 稳定性好、 易于分析, 可用于人类多 种疾病的检测, 特别是泌尿系统疾病。 然而, 尿液 蛋白质组学

15、研究同样也具有变异度大、 影响因素多 等困难, 特别是样本收集、 处理的过程对结果可能 产生很大影响 4。 本文通过对尿液蛋白质组学方法 的比较和探索, 旨在寻求一种高效、 实用、 重复性 好的尿液蛋白质组学研究方法, 为临床疾病蛋白标 志物的研究奠定基础。1材料和方法1.1据尿液收集、储存和处理方法以及胶条选取 分组选取男性高血压、 糖尿病患者 3例, 年龄45 50岁,尿液白蛋白检测阴性,24h 尿蛋白<0.15 g, 混合3人的尿样, 进行分组。 床边新鲜收集患者 晨尿, 取中段尿30ml, 将混合的尿样分为7组(见表 1。表1实验分组组 1组 2组 3组 4组 5组 6组 7加酶

16、抑制剂 ××××××不加酶抑制剂 ×-80保存 4月 ××××××-20保存 4月 ×丙酮沉淀除盐 ×××××××超滤洗涤除盐 ×PH4-711cm胶条 ××××1PH3-1011cm胶条 ×1 PH3-1024cm胶条 ×1注 :1 染色方法采用考马斯亮蓝染色,其它为银染。 384 通过 PH4-711cm 的胶条所

17、获得的蛋白电泳图 明显优于 PH3-1011cm 的胶条,重复 3次结果,均 发现PH3-1011cm的胶条所得蛋白电泳图无法运用 于下一步比较研究(图片未显示 ;而 PH3-1024cm 的胶条(图3所得到的结果令人满意。 2.3荧光标记所获得的彩色二维电泳图(见图 4。 2.4DeCyder 软件分析结果示例(见图 5。 3讨论 蛋白质组学研究方法不断进展,技术日益更 新,但是最常用的仍然是基于二维电泳和质谱分 析的方法。二维电泳技术用于分析尿液在肾脏疾 病中的诊断意义,已经开始受到研究者的注意 5。 特别是新兴的荧光差异电泳(differencein-gel electrophoresi

18、s,DIGE技术,它可以将不同的 标本标记不同的荧光染料,混合后在同一次二维 电泳过程中进行等电聚焦和 SDS-PAGE 电泳,再通 过对不同荧光染料的读取,获得不同的蛋白表达 图谱,比较差异表达点 6。通过对蛋白点的质谱 鉴定而明确差异表达的蛋白。 本研究通过对临床尿样收集过程中的一些关键 问题进行研究,明确何种方法能在二维电泳图中 获得更多的蛋白表达点,以期获得更多的生物学 信息。最早的一些尿液蛋白质组学研究,并没有 对尿液进行浓缩,由于尿液体积大,蛋白浓度 低,所以尿液蛋白质组学研究很难有效进行 7。 后来虽然进行了尿液浓缩,但方法各异,有些添 加了蛋白酶的抑制剂;有些直接进行蛋白沉淀变

19、 性,获得的相关二维电泳图谱中蛋白点也较为稀 少 8。我们的研究对同一尿样进行了比较,一个 添加了复合的蛋白酶抑制剂,一个没有添加,相 关的二维电泳图谱显示添加了蛋白酶抑制剂的尿样 能够获得更多的蛋白质表达,有利于研究结果的 获得。由于超滤离心所需尿样为 15ml,蛋白酶抑 制剂仅添加 0.3ml,而且可以选择 PMSF 等常用的 一些蛋白酶抑制剂,所以非常方便实用。国内关 于尿液蛋白质组学研究的报道很少,贾雄飞等对 移植后急性肾损伤的尿液进行了研究,他们也采 取了超滤离心的方法浓缩尿液,但是没有使用蛋 白酶抑制剂,所以获得的蛋白点数较少 9。 尿液收集浓缩后,可以放置于 -20和 -80 的

20、保存,而 -20的冰箱为更容易利用的临床设图1蛋白酶抑制剂对二维电泳图谱的影响A :新鲜床边收集尿液,未添加蛋白酶抑制剂 B :新鲜床边收集尿液,即刻添加复合蛋白酶 抑制剂(50:1混合蛋白酶抑制剂 1号德国默克 A:-20保存 4个月B:-80保存 4个月图2保存方法对尿液二维电泳图谱的影响图3不同除盐法对电泳结果的影响图 5DeCyder 软件分析示例:可见差异表达点具体分析数据图示图 4荧光标记的彩色二维电泳图(3种染料标记混合于一块胶内ABBA丙酮沉淀法B反复低温超速离心法A 385备,我们比较了两种不同保存方法对结果的影 响,发现长期保存放置于 -80更为安全,-20 保存容易导致尿

21、液中蛋白质的降解。这和国外相 关的研究一致,他们运用 Western-Blot 的方法证 明,-80对尿液中蛋白组的保存更为有利 10;我 们的研究将分别于-20和-80保存了4个月的样 本进行二维电泳, 结果更直接表明 -80保存者得 到了更多的蛋白表达。尿液中的盐份对二维电泳中的等电聚焦过程有 很大的影响,如果能彻底去除样本中的盐份,就 能在等电聚焦过程中使不同等电点的蛋白得到有效 分离,使结果更为稳定。现在,最常用的除盐法 是蛋白沉淀法,而其中丙酮沉淀由于简便价廉, 被广泛运用。但是,丙酮沉淀法在沉淀和溶解的 过程中会损失样品中部分蛋白 11,我们尝试用反 复超滤的方法除盐,并和传统的丙

22、酮沉淀法进行 比较。结果显示,反复超滤的方法可以减少样品 中蛋白质的丢失,而且除盐效果和丙酮沉淀法相 当,能够通过二维电泳的方法得到较为满意的尿 液蛋白电泳图谱,以供后继研究所用。另外,荧光染料对尿液蛋白的标记效能如何 也是值得研究的问题,我们依照参考文献提供的 方法,进行了同样的标记过程,发现通过除盐和 蛋白定量的尿样能够较为有效地获得标记,进行 双向电泳后,荧光扫描仪可以获得有效的蛋白表 达谱,并且不同的荧光通道可以观察到不同的蛋 白表达,可以运用此方法进行下一步比较研究。 但在此过程中要注意避光,以免荧光簇灭。 目前应用于等电聚焦的胶条,有多种不同的 PH范围和长度可供选择。 一般认为长

23、度越长, PH值 覆盖的范围越广, 得到的结果越多, 研究的通量越 高。 但由于胶条制备过程和尿样蛋白质的特性, 在 哪些范围更容易获得稳定而有效的结果也是值得研 究的问题。 我们比较了使用PH3-10和PH4-7的的胶 条, 发现就11cm的胶条而言, PH4-7的非线性胶条 得到的结果更清晰, 而PH3-11的非线性胶条在偏碱 性范围内得到的蛋白图谱混乱,不利于下一步研 究, 原因可能为尿液中酸性蛋白较多, 对碱性蛋白 可能有一定的影响, 目前技术水平下, 以选用PH4-7的胶条进行临床研究更为合适。 如果要用PH3-10的胶条, 我们认为选用24cm的胶条进行蛋白等电聚 焦, 可以得到更

24、为有效的结果。本研究选用的患者普通尿样检测为蛋白尿阴 性,所以不会受到尿液高丰度蛋白的影响,也不 会受到去除高丰度蛋白过程对实验结果的影响, 如果要对一些有大量蛋白尿患者开展尿液蛋白质组 学的研究,还需要探讨去除高丰度蛋白的方法。 目前关于去除高丰度蛋白的研究也存在一些争议, 有的学者认为高丰度蛋白主要是白蛋白,如果去 除白蛋白可能同时去除了附着于其上的一些有意义 的小分子蛋白,从而减少了获得的数据;但是高 丰度蛋白的存在又会影响二维电泳的结果,所以 有必要开展关于去除高丰度蛋白的相关研究 7, 探 讨具体去除方法和结果的比较,有助于今后临床 肾病研究的开展。4小结本文通过对临床尿液收集方法的

25、初步探讨, 认为尿液收集应即刻加入蛋白酶抑制剂, 否则尿液 在浓缩以及离心过程中可能损失部分蛋白 ; 尿样收 集后应该尽量保存于-80低温中, 特别是长期保 存, -20可能导致部分蛋白降解 ; 除盐可选用反复 超滤离心洗涤的方法, 可较传统的蛋白沉淀法更好 地保留尿液中的蛋白。在目前已有的技术水平下, 如果选用11cm的等电聚焦胶条, PH4-7的范围得到 的结果可能更为可靠, 更适合于初期的研究, 深入 研究建议选用 24cm,PH3-10的胶条进行。参考文献1AebersoldR,MannM.Massspectrometry-basedproteomics J.Nature,2003,1

26、3,422(6928:198-207.2ZhuH,BilqinM,SnyderM.ProteomicsJ.AnnuRevBiochem, 2003,72:783-812.3VeenstraTD,conradsTP,HoodBL,etal.Biomarkers:mining thebiofluidproteomeJ.MolCellProteomics,2005,4: 409-418.4DecramerS,GonzalezdePeredoA,BreuilB,etal.Urine inclinicalproteomicsJ.MolCellProteomics,2008,7: 1850-1862.5ThongboonkerdV.Urinaryproteomics:Towardsbiomarker discovery,diagnostic