EGCG对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子调控的影响

1、EGCG对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子调控的影响         10-02-04 14:33:00     作者：李娟，李彩蓉，程建    编辑：studa20【摘要】  目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子（MCP1和ICAM1）分泌的影响。方法 通过体外培养的大鼠系膜细胞进行研究。设立低糖对照组（NG）和高糖组（HG、E100、E200、E400，为分别含EGCG

2、0、100、200、400g·L-1），分别培养12、24、48h。CCK细胞计数法检测不同浓度EGCG作用下大鼠系膜细胞的OD值，判断细胞增殖情况。采用ELISA方法检测培养细胞上清中MCP1和ICAM1蛋白浓度。结果 EGCG能抑制高糖时系膜细胞的增殖活性，其抑制作用呈剂量和时间依赖的方式。系膜细胞处于高糖环境时，MCP1和ICAM1蛋白表达上调，低浓度的EGCG对MCP1和ICAM1蛋白的抑制效果不明显，高浓度的EGCG能明显抑制MCP1和ICAM1的分泌。结论 在体外高糖条件下，大鼠系膜细胞在48h内以增殖为主，一定浓度的EGCG可抑制其增殖。EGCG可在蛋白水平抑制高糖刺激

3、的大鼠系膜细胞MCP1和ICAM1的分泌。 【关键词】  糖尿病肾病；系膜细胞；单核细胞趋化蛋白1；细胞间粘附分子1；表没食子儿茶素没食子酸酯    ABSTRACT： Objective  To explore the effects of epigallocatechin3gallate (EGCG) on proliferation of mesangial cells and the contents of Monocyte chemoattractant protein1(MCP1) and intercellular adhesio

4、n molecule1 (ICAM1) in high glucose cultured rat mesangial cells. Methods  Rat mesangial cells were divided into control group (low glucose 5.5 mmol·L-1 without EGCG) and experiment groups (high glucose 25 mmol·L-1 with EGCG (0, 100, 200, 400g·L-1), each group was incubated for 1

5、2, 24, 48 hours. The growth inhibiting effect of EGCG on mesangial cells was measured by CCK8 methods. The levels of MCP1 and ICAM1 in supernatant were determined by enzymelinked immunosorbant assay (ELISA). Results  The results showed that hyperglycemia stimulated mesangial cell proliferation

6、and release of MCP1 and ICAM1. EGCG could inhibit cell growth in a dose and timedependent manner. In addition, high concentrations of EGCG could also decrease the levels of MCP1 and ICAM1 in supernatant. Conclusion  EGCG can significantly inhibit proliferation and secretion of MCP1 and ICAM1 in

7、 high glucose induced rat mesangial cells.    KEY WORDS: Diabetic nephropathy;Mesangial cell;Monocyte chemoattractant protein1;Intercellular adhesion molecule1;Epigallocatechin3gallate    糖尿病肾病（DN）是糖尿病特有的慢性微血管并发症，其病变周围常有大量单核/巨噬细胞浸润，后者与细胞粘附分子及化学趋化因子有关。SassyPrigent等1证实在链脲

8、佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型中，肾小球表达过量的细胞间粘附分子1 ( ICAM1)、VCAM1及单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)等细胞因子，导致单核巨噬细胞浸润，随后出现IV型胶原链mRNA增加，系膜细胞面积增加及肾小球肥大。说明糖尿病状态下肾组织中粘附分子、趋化因子导致早期单核/巨噬细胞浸润在致肾小球硬化中起着重要作用。    表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin3gallate,EGCG）为绿茶中的一种有效成分。茶多酚具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗突变、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和增强机体免疫功能等多种生物学效应，对肥胖、糖尿病、肿瘤

9、等多种疾病均有明显的药理作用。本实验采用高糖环境下培养的大鼠肾小球系膜细胞，探讨EGCG干预后对系膜细胞增殖及炎症因子ICAM1和 MCP1蛋白影响，初步探索EGCG对糖尿病肾病的保护机制。    1  材料和方法    1.1  材料    大鼠肾系膜细胞株HBZY1（中国典型动物保藏中心提供），培养于含10胎牛血清（FCS）的正常糖DMEM中，常规置于37、5CO2培养箱中孵育，用0.25胰蛋白酶消化传代，每周传代23次。EGCG购自Sigma公司，纯度98%；正常葡萄糖（含5.5

10、mmol·L-1 D葡萄糖）及高糖（含25mmol·L-1 D葡萄糖）DMEM培养液购自美国Gibco公司；FCS购自天津正江科技有限公司；CCK试剂购自上海同仁化学研究所；大鼠MCP1和ICAM1试剂盒（ELISA）购自美国TPI公司。酶标仪（BIOTEK FL800）为美国产品；细胞分析仪/CASY细胞计数仪为德国CASY公司产品。    1.2  方法8法检测细胞增殖活力    取对数生长期系膜细胞，以2000个/孔铺于96孔板，待细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1%FCS培养液，培养24h

11、使所有细胞的生长同步化。随即分5组：NG组（对照组，葡萄糖5.5mmol·L-1），HG组（高糖组，葡萄糖25mmol·L-1），E100组，HGEGCG（100g·L-1），E200组，HGEGCG（200g·L-1），E400组，HGEGCG（400g·L-1）。空白对照组只加低糖培养基而不加细胞。各组分别培养12、24、48h，终止前2h在每个孔内加入10l的CCK8试剂。应用Spectrafluor Plus光度仪（TECAN公司）在450nm处测定吸光度。以空白对照组调零，每组设3个复孔。吸光度的改变反应细胞活力的变化。 &

12、#160;  双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清中MCP1和ICAM1含量，按试剂盒说明书操作。每项指标设6孔，根据标准品的标准曲线求出相应的含量，为排除细胞数目对上清中MCP1和ICAM1含量的影响，对每孔细胞数目进行校正，按每孔细胞数为1×106个来校正所得数据。    1.3  统计学处理    采用SPSS12.0统计软件包进行统计学处理，率的比较用2检验，计量数据采用均数±标准差(±s)，进行方差分析和Studentt检验，以P<0.05为显著性标准。&

13、#160;   2  结  果    2.1  CCK8法检测的各组细胞增殖活力比较    培养48h以内，高糖可促进系膜细胞的增殖(与对照组相比，P<0.05 ) 。作用早期(12h)EGCG对细胞生长的抑制作用不显著；随作用时间的延长(24h及48h)，各浓度组EGCG的抑制作用明显增强。对于同一浓度的EGCG而言，随着作用时间的延长抑制率升高；对于同一时间而言(24h及48h)随EGCG浓度的升高，抑制作用加强。说明EGCG对细胞生长的抑制作用具有时间、剂量依赖效应。见表1。表1  不同浓度、时间的EGCG作用于各组大鼠系膜细胞的OD值（CCK）比较与NG组比较，*P<0.05、*P<0.01；与HG组比较，P<0.05、P<0.01    2.2  ELISA法检测细胞培养上清液MCP1的含量比较    本研