局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡的影响

1、局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡的影响        【摘要】     目的 研究局部亚低温对脑缺血后半胱天冬氨酸酶3（caspase3）、凋亡诱导因子（AIF）和微管相关蛋白2（MAP2）表达的影响，探讨亚低温的脑保护机制。方法 采用改良的Longa法制备永久性大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。低温组在缺血后立即给予贴敷式局部亚低温（33）2 h。分别于缺血后2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、1周和2周取脑，进行HE染色，并采用SABC法进行免

2、疫组化染色，检测caspase3、AIF和MAP2的表达。结果 脑缺血后2 h，梗死灶周围即出现caspase3和AIF免疫阳性细胞，24 h达高峰，之后开始逐渐减低，但在2周时仍可见少量免疫阳性细胞。caspase3在缺血中心区和周围区均有表达，而AIF主要表达于脑梗死周围区。与常温组相比，低温组caspase3和AIF表达显著减低（P<005），而MAP2显著增加（P<005）。结论 亚低温能抑制缺血后脑组织caspase3和AIF表达，促进MAP2表达；并可抑制caspase介导的细胞凋亡,抑制不依赖于caspase的AIF介导的凋亡。    &

3、#160;【关键词】  亚低温；大脑中动脉闭塞；半胱天冬氨酸酶3；凋亡诱导因子；微管相关蛋白2    Effect of local mild hypothermia on neuronal apoptosis following focal cerebral ischemia in rats ZHANG Yan, WANG Desheng. Department of Neurology, the First Clinical Hospital of Harbin Medical University, Harbin, 1

4、50001, ChinaAbstract：Objective  To study the effect of local mild hypothermia on the expression of  cysteine protease caspase3, apoptosisinducing factor(AIF) and microtubuleassociated protein2(MAP2) after focal cerebral ischemia in rats, and to disclose the mechanism of neuroprotection by

5、mild hypothermia.Methods  The model of permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established in Wistar rats. Intraischemic local mild hypothermia was applied for 2 hours (33) in the hypothermia group. After survival period of 2h, 6h, 12h, 24h, 3d, 1w and 2w, the rats were anesthetiz

6、ed and the brains were removed. Hematoxylin & eosin staining was used to identify cerebral infarcts. Immunohistochemical analysis was used to detect expression of caspase3, AIF and MAP2. Results  The immunoreactivity of caspase3 and AIF was detectable after 2hour ischemia in the penumbra re

7、gion, and it increased significantly after 24 hours, then decreased gradually. There were a few immunoreactivity positive neurons after 2 weeks. Immunoreactivity positive neurons of caspase3 were in ischemic core and penumbra. AIF expressed mainly in the nucleus in penumbra. Compared with normotherm

8、ia group, the expression of caspase3 and AIF was significantly lower, and MAP2 was significantly higher in hypothermia group.Conclusion  Mild hypothermia decreases the expression of caspase3 and AIF, and increases the expression of MAP2， and it can prevent apoptosis from inhibiting both caspase

9、dependent and caspaseindependent neuronal cell death pathways.Key words：mild hypothermia, middle cerebral artery occlusion；cysteine protease caspase3；apoptosisinducing factor；microtubuleassociated protein2亚低温是目前已证实有效的神经保护措施，但是确切的保护机制尚不清楚。亚低温可以降低脑代谢率，减少兴奋性氨基酸递质的释放，减少钙离子内流和促进蛋白质合成等1，2。亚低温通过影响凋亡生化途径中的相

10、关因子，对实验性脑缺血具有神经保护作用 3，4。本实验采用永久性大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，观察局部亚低温对急性脑缺血损伤后半胱天冬氨酸酶3（caspase3）、凋亡诱导因子（AIF）和微管相关蛋白2（MAP2）表达的影响。1  材料与方法1.1  动物与分组  健康雄性Wistar大鼠102只，质量180220 g（由哈尔滨兽医研究所动物室提供）。随机分为4组：(1)常温缺血组（NT组）49只，再分为7个亚组，即37条件下缺血后存活2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、1周、2周，每组7只。(2)低温缺血组(HT组)49只，再分为7个亚组，即33条

11、件下缺血后存活2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、1周、2周，每组7只。(3)常温假手术组（2只）。(4)低温假手术组（2只）。1.2  方法2  结果2.1  HE染色结果  HT组和NT组显示梗死病灶的分布与阻塞的大脑中动脉（右侧）为同侧，而左侧半球脑组织正常。大鼠脑梗死病灶主要分布于基底节、额叶、颞叶和顶叶皮质等。脑梗死周围区半暗带镜下可见血管和小胶质细胞增生明显，神经细胞的形态基本正常。2.2  免疫组化阳性结果图1  HT组24 h caspase3阳性细胞，神经元胞浆充满褐色颗粒（×40）（略）图2

12、60; NT组梗死中心区caspase3阳性细胞，神经元形态不规则，胞核固缩，胞浆充满粗大、浓染的褐色颗粒（×40）（略）图3  HT组24 h梗死中心区和周围区MAP2染色，梗死中心区MAP2染色阴性，周围区MAP2表达增加（×40）（略）HT组缺血24 h和3 d时AIF阳性细胞显著减少。见表1。表1  各组caspase3和AIF阳性细胞数比较（略）注：与NT组缺血2 h组比较*P<005;与HT组缺血2 h组比较P<005;与NT组相应时间点相比P<005表2  各组MAP2 AF的比较（略）注：与NT组相应时间点相比

13、*P<005图4  HT组24 h AIF阳性细胞，正常的神经元胞浆充满褐色颗粒，胞核染色阴性；形态异常的神经元胞核充满褐色颗粒（×40）（略）3  讨论研究表明,脑缺血激活内源性和外源性caspase介导的细胞凋亡途径,其中caspase3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，它的激活最终导致DNA断裂；脑缺血同时也激活了AIF介导的凋亡。AIF是含量丰富的线粒体蛋白，在凋亡信号的刺激下，AIF从线粒体释放易位于细胞核，导致核DNA降解，断裂为50kbp的DNA片段，此过程不依赖于caspase。在脑梗死超早期，缺血半暗带内神经元的损伤就是以细胞凋亡为主，因此研

14、究亚低温对缺血性神经元凋亡的影响，可以进一步阐明亚低温的脑保护机制6，7 。本实验发现caspase3免疫阳性细胞除了在脑梗死周围区表达外，更多的分布于病变的中心区，这与文献8，9的报道相似。在大鼠MCAO后2周，梗死周围区仍存在少量免疫阳性细胞，说明该区域还有发展为不可逆性损伤的可能。与以往的研究主要集中于缺血早期（3 d以内）不同。本实验观察了亚低温治疗后2周内细胞凋亡因子的动态变化，结果表明亚低温能抑制caspase3的表达，减少神经元凋亡。由于细胞色素C（Cyt C）可激活caspase，而活化的caspase也能刺激线粒体释放Cyt C，因此亚低温可能通过抑制Cyt C，进而降低ca

15、spase3的水平，或是直接抑制caspase3的表达。Xu等10采用离体神经元凋亡模型，发现亚低温（33）可以降低caspase3表达水平。Phanithi等11应用大鼠MCAO模型发现全身亚低温（33）可以使caspase3表达下降，而且caspase3水平与凋亡阳性细胞数呈正相关。本实验发现AIF免疫阳性细胞主要位于脑梗死病灶的周围区。从缺血6 h开始， AIF阳性细胞形态出现异常，表现为核固缩和核裂解等改变，提示AIF可以促进DNA的损伤，但是确切的作用机制尚不清楚12。NT组在缺血24 h，细胞核表达AIF免疫活性的神经元达到最多，凋亡细胞更多见，但并不是所有的凋亡细胞呈现AIF免疫

16、阳性。除死亡受体途径外，还至少有两条联系线粒体和核凋亡的平行通路共存，一条依赖于AIF的线粒体外分布，并导致大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体聚集；另一条依赖于Cyt C、凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf1）和casapses的激活，从而导致寡核苷酸样DNA小片段的生成和更进一步的染色体凝集，因此凋亡细胞中仅有一部分呈现AIF免疫阳性。MAP2主要存在于神经元的胞体和树突中，缺血后MAP2表达减弱，是神经元损伤的敏感指标13。NT组在缺血24 h，caspase3和AIF免疫阳性细胞数达到高峰，而MAP2的AF值降至最低；HT组中，caspase3和AIF免疫阳性细胞数比NT组显著降低，而

17、缺血周边区MAP2表达上调，AF值显著性增高，说明亚低温可以抑制凋亡相关因子的表达，减少神经元凋亡的发生，并促进受损神经元的恢复。本实验选取大鼠永久性MCAO模型，发现亚低温能选择性干预蛋白质合成，抑制caspase3和AIF的活性，使缺血周边区MAP2表达上调。结果表明亚低温可以抑制内源性和外源性caspase介导的细胞凋亡,亦可抑制不依赖caspase和AIF介导的凋亡。    【参考文献】  1Auer RN.NonPharmacologic (Physiologic) neuroprotection in the treatment o

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