硝酸纤维素膜微粒ELISA方法的建立

1、    硝酸纤维素膜微粒ELISA方法的建立        ESTABLISH OF NITROCELLULOSE MICRO-PARTICLES ELISA METHOD本文报道硝酸纤维素膜微粒ELISA（nitrocellulosemicroparticleELISA，NCMPE）方法，该法可用含表面活性剂的混合抗原定量测试针对其中某一组分的抗体，具体如下。1方法1.1混合抗原直接测试按文献报导方法1，将1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10丙烯酰胺溶液，聚合后在10&#

2、176;C、200mA、2h条件下大鼠血清蛋白电泳吸附于NC膜，用蒸馏水漂洗后，切一10×100mm小条装入10ml试管备用。对照组将同样面积空白NC膜用蒸馏水漂洗后备用。在上述装有NC膜的试管中加入10ml DMSO，充分摇匀，室温1h；加入等体积01molLpH90碳酸氢钠溶液，充分混匀。3000rmin离心35min，收集沉淀，即为含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用001molLpH7.4PBS-T洗涤离心3×5min；用含0.3的1：50正常羊血清封闭、阻断37°C30min或4°C冰箱过夜；同上离心后用PBS将微粒体积调至5ml、用0.5ml离心管

3、分装，每管加入100l微粒悬浊液；在各管中分别加入100l倍比稀释的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗涤离心3次，加入100l含0.1molL柠檬酸、0.2molL磷酸氢二钠、双氧水、邻苯二胺底物溶液，于37°C暗环境反应120min；每管加入1滴2molL硫酸终止反应，同上离心，收集上清并加入96孔酶联板，用酶标仪测试波长490nm处OD值。重复测试3次。1.2电泳分离抗原测试首先免疫转印鉴定抗原，再根据免疫转印结果进行定位，将特定抗原带裁下，测量NC膜面积，同上将NC膜微粒化处理并进行定量免疫测试。2结果用混合抗原直接测试和用电泳分离抗原进行测试，抗体浓度与

4、OD值间均有较好线性关系，当抗体浓度为0.2510ngml时线性最好，且阳性组和阴性对照组OD值落在最佳范围（见表1），即阴性对照组OD值为0.3左右，阳性对照组为1.0左右。3次重复结果一致。表1NC膜微粒ELISA法测试羊抗鼠IgG抗体浓度（ngml）与OD值（±s）结果Tab 1Concentration of goat anti-mouse IgG antibody test with micro-particles ELISA method（±s）and OD vsConcentration of goatanti-mouseIgG antibobyOD vs c

5、oncentration of antibody in each GNegative GDirect absorb G*Western blot G0.06250.004±0.0000.070±0.0150.060±0.0120.12500.067±0.0090.349±0.0550.317±0.0400.25000.179±0.0260.752±0.1620.700±0.1520.50000.334±0.0451.173±0.5631.170±0.5041.00000.49

6、2±0.0481.697±0.2201.597±0.2202.00000.682±0.0752.493±0.3252.294±0.301*?tested with complex antigen；tested with electrophoresis isolated antigen 3讨论用ELISA法进行测试时，包被条件非常关键，对用于包被的抗原或抗体要求较高，其应用范围受限制。NC膜具有很强的吸附能力，从而出现了以该材料为基础的斑点免疫检测法24。其对被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于检测，但吸附时间长、费时，被吸附抗原如果

7、含有表面活性剂便不能用于检测。为了克服上述缺点，我们曾建立了一种电泳吸附斑点免疫法1，但该法需要将NC膜逐一截成小圆片放入酶联板中，操作也不方便，定量不够准确。NCMPE法将电泳吸附抗原的NC膜变成微颗粒，分装方便，能保证其均一性，定量准确，由于在离心管中操作、洗涤等处理极为方便。免疫转印技术是抗原抗体检测方面的重大突破，但应用该方法难以将抗体定量。NCMPE法将免疫转印识别的特定抗原带处理成微颗粒，然后用ELISA法定量测试抗体水平，充分发挥了免疫转印技术的高分辨率和ELISA定量法的高度精确性与高度灵敏性，可极为方便而准确地将某种未知抗体定量。作者简介第一作者：男，32岁，博士，副主任医师

8、作者单位：白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科，中国人民解放军耳鼻咽喉病中心头颈肿瘤分子生物学实验室石家庄050082参考文献1邹静，翟所强，姜泗长，等.豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析.中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30（1）：132Hakwes R， Nidy E， Gordon J A dot-immunobinding assay for monclonal and other antibody Anal Biochem，1982，119：1423Hakwes R The dot immunobinding assay Methods Enzymol，1986，121：4844Steinitz M， Rosen A， Klein G An improved dot immunobinding assay fo