RNA干扰技术研究进展及其应用

1、爱德牛业RNA干扰技术研究进展及其应用崔照琼,王旭东(云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201摘要:RNA干扰(RNA i现象是生物界的一种保守行为,能特异性的抑制同源基因表达,具有维持基因组稳定性和抵抗病毒入侵的作用。作者综述了RNA i的基本原理、作用机制及其应用,并对RNA i在基因治疗上的应用前景进行了展望。关键词:RNA干扰;基因表达抑制;基因治疗中图分类号:Q75文献标识码:A文章编号:167127236(200503200272041998年F ire等首次把双链RNA(dsRNA注射入一种线虫(caenorhabd itis eleg ans体内,dsRNA 使互补的m

2、RNA降解,诱导了靶向性的基因表达沉默(gene silencing,这一现象称为RNA干扰(RNA in terference,RNA i。同植物中的共抑制(co2 supp ressi on或转录后基因沉默(po st2 tran scri p ti onal gene silencing,PT GS、真菌中的基因表达压抑(quelling一样,RNA i也是一种典型的转录后基因表达调控方式,是美国Science和N atu re评出的2002年度最重要的科技成果之一,正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。康奈尔大学的Guo等(1995利用反义RNA(an tisen se RNA技术特

3、异性地阻断秀丽新小杆线虫(C. eleg ans中的p ar21基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sen se RNA相反的结果,但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par21基因的表达途径。直到1998年,F ire等的研究结果证明,在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA,这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的,这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA i。随后的研究结果发现,RNA i现象在多种生物中存在,如线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及植物等,生物体可利用RNA i来抵御病毒的感染,阻断转座子的作用(Zam o re等,2000。1999年T

4、u sch l等报道在哺乳动物中也存在RNA i,只是导入的RNA是小干扰RNA(s m all in terfering RNA,si RNA(T u sch l等,2002;2001年B erstein等提出:只有22核苷酸(n t,nucleo tide才能特异性地阻断dsRNA,同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为si RNA的叫D icer的酶(A gam i,收稿日期:2004212202作者简介:崔照琼(1980-,云南人,硕士生,研究方向:兽医传染病学与分子流行病学。2002。近几年来RNA i的研究取得了很大进展,他被Science杂志评为2001年的十大科学成就之一。2

5、002年RNA i的研究又有了新的突破,发现他在基因表达调控中发挥重要作用,他也名列2002年Science杂志评的十大科学成就之首。1RNA i生物学意义转座因子和病毒等外源核酸的引入能破坏宿主细胞基因组的稳定性。转录后基因沉默,就是宿主将外源基因视为对自身有害的序列而抑制其表达。细胞对外源核酸的这种抑制作用具有序列特异性的特点,细胞转录后基因沉默机制启动后,细胞对外源核酸的同源序列就具有了抑制其表达能力,是生物体在进化过程中形成的一种维护自身稳定性的防御手段。RNA i主要发生在胞浆中,也可发生在细胞核中。在RNA i过程中,目的基因DNA没有发生改变,转录过程仍在进行,但细胞核和细胞浆中

6、同源m RNA减少,蛋白合成降低,引起特异基因表达抑制,说明RNA i现象发生在转录后,蛋白质合成前。RNA i现象的机制目前还没有完全弄清楚,涉及到很多不明功能的酶和蛋白质,其中已鉴定出的与RNA i相关的酶有双链RNA特异性核酸内切酶D icer,RNA依赖的RNA聚合酶R dR P。D icer是RNA i作用的关键成分,具有解旋酶活性及dsRNA 结合域和PA Z结构域,属于ribonuclease 超家族的一员,在进化上非常保守,能特异性切割双链RNA,产生si RNA;si RNA是RNA i作用的重要组分,是RNA i发生的中介分子。2RNA i的作用机制RNA i属于转录后基因

7、沉默机制,其本质是si RNA高效、特异地阻断体内同源基因表达,致使m RNA降解和基因表达受抑。研究结果表明,RNA i 广泛存在于各种生物体,植物、真菌、锥虫、果蝇和哺乳动物中都发现了RNA i现象(A gam i,2002。自然界中,RNA i可能是动植物体内的一种保护机制,主要作用在于防御病毒感染,维持基因组中转座子的稳定,参与胚胎发育等。RNA i的具体机制和过程尚未十分清楚,可能的作用机制是细胞内双链RNA 在D icer酶的作用下,可形成22bp大小的si RNA, si RNA可进一步掺入多部分核酸酶(m u lticom ponen t nuclease,R ISC并使其激活

8、,从而精确降解与si RNA序列相同的m RNA,完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。RNA酶 是一种能切割双链RNA的酶,参与RNA i反应的D icer酶是RNA酶 家族的一个成员。D icer酶广泛存在于蠕虫、真菌、植物及哺乳动物体内,他的结构中包括1个螺旋酶结构域,2个RNA酶 结构域,1个双链RNA结合位点。在D icer酶的作用下,双链RNA被裂解成2123个核苷酸的si RNA,他启动了细胞内的RNA i反应(B ern stein等,2001。因少量双链RNA即能阻断基因表达,且此效应可传至子代细胞,研究者们推测细胞内存在RNA i效应的扩增系统。研究者们发现,在真核细胞中也

9、存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA2directed RNA po lym erase, R dR P。在R dR P的作用下,进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程,呈指数级的数量扩增。双链RNA进入细胞后,一方面在D icer酶的作用下被裂解成小片段si RNA,另一方面在R dR P的作用下自身扩增后,再被D icer酶裂解成si RNA。小片段si RNA生成后与核酸酶形成复合物,随后m RNA与小片段的正义链置换,被m RNA 替代。m RNA的位置与最初正义链的位置相同,从而被核酸酶在相同的位点降解。更有意义的是m RNA的降解使核酸酶得以再生,这样周而复

10、始, m RNA得以降解,因此RNA i呈酶解动态(Svoboda 等,2000。由于m RNA也以2123n t的特定间隔降解,因此认为降解dsRNA与m RNA的核酸酶相同。另一方面以si RNA作为引物,以m RNA为模板,在R dR P作用下合成出m RNA的互补链。结果m RNA也变成了双链RNA,他在D icer酶的作用下也被裂解成si RNA。这些新生成的si RNA也具有诱发RNA i的作用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的si RNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制(T u sch l等,2002;A gam i,2002;B ern stein等, 2001。RNA i

11、不同于其他基因阻断技术,他是转录后水平的基因静默机制,因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。RNA i 具有较高的特异性,能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的m RNA,且抑制基因表达效率很高,相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度,但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果。dsRNA小片段如小于21 23n t(如1015n t,特异性将显著降低,不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用,如远远大于21 23n t,互补序列可能延伸,超出抑制范围。RNA i 基因表达的效应可以突破细胞界限,在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持,并可传

12、递给子一代(Svoboda等,2000。3RNA i在细胞中的研究和双链RNA的构建3.1小鼠胚胎细胞中也存在RNA iB illy等(2001的研究结果表明,在小鼠的胚胎细胞中也存在RNA i。将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞,诱发了细胞内的RNA i机制,并抑制了报告基因的表达。但大于30个核苷酸的双链RNA 进入哺乳动物的成体细胞后,会非特异的阻断基因的表达。因为长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后,细胞内的病毒防御机制被激活;且RNAL (RN ase L被激活,产生非特异的m RNA降解。而未分化的胚胎细胞中,上述防御病毒的机制存在缺陷,因而双链RNA能特异的阻断基因

13、的表达,但T u sch l等的研究克服了这一障碍,他们发现,21个核苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNA i机制,同时不会激活细胞内的干扰素(E lbash ir等,2001。他们合成了以荧光素酶的m RNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA,将他和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到N I H3T3、CO S27、H ela S3和293细胞中,报告基因的表达被抑制了90%。由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况,他们又合成了细胞内源性基因lam inA C为靶目标的双链RNA,这个双链RNA也特异的抑制了lam inA C的表达,抑制率达到90%以上。3.2双链RNA的构

14、建双链RNA可先在体外构建好,用脂质体转染细胞,但有些细胞脂质体转化效果差,转化到细胞内的双链RNA半衰期短,而先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转到细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。构建双链RNA表达载体,使用RNA多聚酶 指导RNA的合成,因为RNA多聚酶 有明确的启始和终止序列,当RNA多聚酶 遇到连续5个胸腺嘧啶时,他指导的转录就会终止,且转录产物在第2个尿嘧啶处被切下来,因此合成的RNA无po lyA尾。U6启动子能被RNA多聚酶 识别,合成出RNA。Su i等(2002用b lue

15、scri p t作为载体,RNA多聚酶 可识别的U6作为启动子,从绿色荧光蛋白(GFP的基因上选择了一个21个核苷酸的片段(片段1,将其插入到b luescri p t载体中,然后合成出片段1的反向重复序列,并在其后加了5个胸腺嘧啶,称为片段2。他们将片段2接到b luescri p t载体中片段1的后面,将载体转移到细胞中后,转录出的RNA由于具有回文序列,会形成一个发卡样结构,从而得到了双链RNA。片段后面加了5个胸腺嘧啶,RNA转录到这个位置时就会终止,而且转录出的RNA形成发卡样结构后,会在3端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的si RNA,因而有利于双链RNA诱发RNA i。RNA

16、多聚酶 亦识别H12RNA启动子,在H12RNA启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列,将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA(B rumm elkam p等,2002。T7也可作为启动子合成dsRNA,将PCR产物用N o t I酶切后自身连结,回收正向片段和反向片段连结形成的具有反转重复序列的片段,接到pGE M T easy载体上,就构建成了可以表达dsRNA的载体。用此载体可先在体外合成dsRNA,或将其转入到细胞内合成dsRNA。在后一种情况下,还须将能表达T7RNA 多聚酶的载体也一起转入到细胞中,以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶(Yang等,2001。腺病毒是体内

17、转基因的常用载体,X ia等(2002用腺病毒做载体,在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达。4RNA i的试验方法双链RNA在D icer作用下生成的si RNA是RNA i作用的重要组分,具有互补的双链结构,在3端带有2个突出碱基,是RNA i发生的中介分子。目前,诱导RNA干扰有很多种方法,各有其优缺点:化学合成法,应用最广泛但成本昂贵,体外合成的长为21n t,3端带有2个突出碱基的si RNA较其它形式合成的RNA具有最大效率的降解目的m RNA的效果,突出碱基为核糖核酸较突出碱基为脱氧核糖核酸具有更大的诱导效果,一个碱基的错配,能明显的降低干扰的效率;si RNA表达

18、载体,在质粒或病毒载体中,利用RNA聚合酶启动子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并在细胞内退火形成双链si RNA,或在聚合酶启动子下游设计带发夹结构的表达单位,表达后自身退火形成双链si RNA;利用载体表达长的dsRNA,多用于果蝇、线虫等低等生物中,在体内表达后被D icer切割成2123n t的Si RNA,引发特异地基因表达抑制;或在体外利用D icer、RN ase 切割dsRNA,产生si RNA,纯化后使用;长的dsRNA在哺乳动物细胞中能激发非特异性反应;但已有研究结果表明在鼠胚胎或胚胎细胞系中,长500n t的dsRNA也能诱发特异的基因表达抑制。5RNA i技术的应

19、用依据RNA i现象,科学家建立了RNA i技术,即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。dsRNA的合成包括化学合成法、体外转录法、转录载体体内转录法等。其中,以DNA为模板体内合成si RNA载体的成功应用,为RNA i的研究提供了更为简便和实用的方法,使RNA i技术真正成为了可被广泛采用的有力工具(M iyagish i等,2002。RNA i技术在基因功能的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。首先,RNA i具有较高的特异性,只引起与dsRNA同源的m RNA降解。RNA i技术中si RNA序列选择余地大,2123个核苷酸中只要改变1个核苷酸,

20、就可以使该si RNA序列不对靶向m RNA起作用,因此RNA i可用来抑制单个核苷酸突变基因的表达。5.1高通量研究基因功能基因功能研究现在已经明确,双链RNA i技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的表达,而且也可抑制体内特定基因的表达。在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。21n t si RNA的双链复合物在哺乳动物细胞中干扰成功为基因作用的研究提供了一种新的工具,原来要花费6个月到1年才能明确1个哺乳动物细胞基因如何关闭,现在只需1个星期就能明确10个基因的关闭,使工作进程大大加快。可以预见, RNA i作为一种快速静默基因的途径,将会越来越多地用于哺乳

21、动物基因研究。将功能未知的基因的编码区(外显子或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA 可形成dsRNA,产生RNA i,使目的基因静默,从而进一步研究目的基因的功能。根据所选用序列的不同,可将其分为编码区RNA i和启动子区RNA i(X ia等, 2002。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNA i将大大促进对这些新基因功能的研究(Zhang等,2003。5.2研究信号转导通路的新工具由于RNA i能高效特异的阻断基因的表达,他成为研究信号传导通路的良好工具。在线虫体内,胰岛素和受体结合后可以活化D so r1,他是

22、M ek的类似物,D so r1活化后可以激活EekA,他是ER K的类似物。用以D so r1为靶目标的dsRNA可以阻断D so r1的表达,虽然总的E rkA的表达不受影响,但由于D so r1的表达被抑制,因而胰岛素刺激后E rkA不能活化(M o rris等, 2002。5.3基因治疗的新方法用RNA i特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症。而肿瘤是多基因、多因素疾病,单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果,但RNA i技术能够同时抑制多个不同基因

23、,而且抑制效果互不干扰。此外,RNA i识别可以精确到1个核苷酸,对由野生型点突变形成的癌基因,如ras,p53等,能够产生准确有效的封闭效果,野生型基因则不受影响。试验结果证明,bcl22、CD K22、PL K21和p53等肿瘤相关基因的RNA i,能够使人类宫颈癌细胞(H eL a增生速度减慢,恶性程度降低,凋亡加快。肝癌(H ep3B、非小细胞肺癌(H1299、头颈部鳞状细胞癌(C332A、骨肉瘤(U22O S及前列腺癌(LN CaP(L in等,2001、白血病(W ilda等,2002等细胞系中的试验也发现类似效应。此外,将RNA i应用于W ilson病等先天遗传性疾病的体外试验

24、也获得令人满意的结果(O h等,2002;H annon等,2004; Celo tto等,2004;T ang等,2004;V i2tei等,2004;H sieh等,2004;Cap len等,2003;Yo sh inari等, 2004;Kw ong等,2004。2002年9月,科学家采用这项技术完全清除了生长在试管中的所有癌细胞,而未伤及正常细胞。随着这一研究结果近日的公布,另一个小组的研究人员正设计这一技术在世界上的第一次临床试验,该试验将在一组艾滋病患者中进行。由于双链RNA干涉,通过使有害的基因“静默”而奏效,因而科学家认为,可用其来静默感染的病毒基因或已转为恶性的肿瘤细胞,从

25、而使他们变得无害。5.4反向遗传学上的应用随着各种模式生物和人类基因组测序的完成,基因功能的研究远远落后于大量序列所提供的信息,研究和发现基因的功能成为越来越紧迫的任务。长期以来,破坏基因结构或抑制基因或基因簇的表达是研究该基因功能的重要方法,如常用的基因敲除技术(gene knock2ou t。基因敲除技术对所研究的基因要有详细的认识,较长的时间才能决定基因与表型的关系。自RNA i现象发现后,因其操作简单,作用迅速,具有较高的特异性,获得了生物学家的青睐,首先应用于反向遗传学和基因功能的研究,尤其是植物和低等生物如病原微生物,能迅速而方便地使某个基因失去功能。因而,能更快的决定基因与表型的

26、关系。RNA i技术还具有的一个优势是能同时对多个基因或基因家族进行研究,或应用于研究m RNA差别剪接形成的异构体,甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNA i 表达载体,对于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查,具有更大的优势。相对于基因敲除技术长期抑制基因功能,RNA i技术仅仅是使基因表达暂时降低或抑制“knock-dow n”,基因组的信息仍是完整的。利用RNA干扰技术先封闭基因的表达,然后再激活,通过前后基因表型的变化,能很方便的鉴定出基因的功能。线虫是研究RNA i现象的最好模式生物, dsRNA可通过浸泡在含dsRNA的溶液中,喂食表达dsRNA的细菌或注射的方式导

27、入线虫体内,诱导RNA i现象。A h ringer等应用RNA i技术研究了秀丽线虫的基因组(覆盖了1 3的基因组,提供了大量的有关线虫发育和生存必需基因的知识。RNA i技术为研究发育过程中基因的功能提供了一个手段,能很容易地制造出突变型个体。Am dam等把dsRNA注入囊胚前期的蜜蜂卵或初生蜜蜂腹内,封闭vitellogen in基因的表达(vitellogen in基因在成体后才出现表型,结果分别有15%和96%的个体出现突变型。15d后,仍能检测到dsRNA片段。在进行反向遗传学研究时,RNA干扰技术也能用来寻找药物治疗靶点,H ideo等利用RNA i技术减少了丘脑下部A GR

28、P(agou ti2related pep tide50%的表达量,A GR P使代谢率提高而不用减少摄食量,从而减轻肥胖,为肥胖的治疗提供了一个靶点。用于疾病机理研究,针对Fas介导的信号通路在肝脏疾病中的作用,在鼠模型中,利用RNA i技术干扰Fas通路能明显降低自身免疫性肝炎引起的肝衰竭和纤维化,说明了Fas通路在肝脏疾病中所起的作用。6问题与展望RNA i技术有望应用于临床以前,应解决几个问题:在设计表达si RNA的载体或合成si RNA 时,1个碱基的差别将会明显的降低RNA i的效率;另外,To rgeir等研究结果表明,针对m RNA的不同位点,化学合成的si RNA具有不同的

29、诱导RNA i效率,提示在人类m RNA中,能有效诱导RNA i的位点有限,因此要筛选有效位点,确保治疗效果;si RNA转导入细胞中的效率有待提高,这是RNA干扰技术应用于临床的主要障碍,在培养的细胞中取得较高的转导效率,在体内不一定有这么高的效率,应发展更好更有效的转移载体,能进入细胞内稳定的表达si RNA;si RNA的稳定性和作用的长期性,si RNA 很容易被细胞中的R nases降解而失效;用DNA质粒和病毒载体表达有茎环结构的si RNA能减少降解,提高RNA干涉的效果和维持较长的作用时间。载体表达的si RNA比化学合成的si RNA具有更高的稳定性,在体内作用也更持久,在将

30、来的基因治疗中,应具有更广阔的应用前景。各种表达载体或合成RNA 的毒性作用还有待研究。随着RNA i机理的逐步阐明,RNA i技术正以令人兴奋的速度发展,并不断开辟新的应用领域,各种更好更有效的载体和转移系统的建立,为深入研究和应用提供了前提。RNA i技术在反向遗传学和临床治疗中定会取得更大的成果。参考文献1A gam i R.Curr Op in Chem B i o l,2002,6:829834.2Bernstein E,et al.N ature,2001,409:363366.3B illy E,et al.P roc N atl A cad Sci U SA,2001,98:1

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