体外溶栓放射分析方法

1、第11卷第4期1998年11月同位素JournalofIsotopes.11No.4VolNov.1998王映兰刘厚孝(,天津300193)(中国医学科学院放射医学研究所,天津300192)用125I标记的纤维蛋白原与富血小板人血浆制成类天然栓子,栓子侵入含溶栓剂的富血小板血浆中温育,通过测量血浆的放射性活度,计算出溶栓率,建立起体外溶栓放射分析方法,并对有关影响因素进行了初步的分析,也对重组葡激酶(STAR)、链激酶(SK)和组织纤溶酶原激活剂(t2PA)的溶栓效果进行了观察。这为血液凝溶基础研究、溶栓药物的筛选和溶栓剂的溶栓效果评价提供了理想的手段。关键词血栓病溶栓剂放射分析中图法分类号R

2、81711O613144R97312血栓病发病率、死亡率和致残率逐年升高,严重地威胁人类的健康和生命,因此,加强血栓性疾病的研究和溶栓药物的开发已成为医药界的共识。以往,体外溶栓效率是用纤溶酶原激活程度1,3,或者纤维蛋白水解产物表示4。这类方法麻烦费时,且不具特异性。Pannel5和6125Satosh根据纤溶酶原在其激活剂(溶栓剂)作用下,变成有活性的纤溶酶水解I标记纤维蛋白原制成的栓子,通过测量反应液中的放射性活度,计算出溶栓效率。本研究将125I2纤维蛋白原混于正常人血浆中制成类天然人血栓块,然后将125I2血栓块浸入含有待测溶栓剂的正常人血浆中保温。由于方法采用类天然放射性栓子和正常

3、人血浆反应液,因此,具有良好的的特异性、灵敏度和稳定性。1材料和方法111材料人纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)和1,3,4,62四氯23262二苯基甘脲(Iodogen)由Sigma公司提供;葡聚糖凝胶(SephadexG75)由Pharmacia公司提供;牛凝血酶(Thrombin,TB)由中国医学科学院血液病学研究所提供;Na125I:放射性浓度为918TBq L,无还原剂,由中国核动力研究设计院提供;重组葡激酶(RecombinantStaphylokinase,STAR):6.0×104U mg,由青岛双龙制药有限公司提供;重组链激酶(RecombinantStre

4、ptokinase,RSK):5×105U 瓶,由HavanaCuba公司提供。杨熠:女,31岁,助理研究员,在读硕士,药理学专业收稿日期:1998201213修改稿收到日期:1998206203第4期杨熠等:体外溶栓放射分析方法201112方法11211125I2Fg制备及鉴定7在含20gIodogen具塞锥型塑料管内加入100L50mol L125pH7.4磷酸缓冲液,50L5%纤维蛋白原液和10LNaI溶液(约37MBq),室温振荡反应30min后,加入50L含5mgFg的1%碘化钠载体溶液终止反应,反应液迅速转移到预先用50mmol LpH7.4磷酸缓冲液平衡的Sephade

5、xG75柱上层析分离,以平衡液洗脱,自动收集每管200L,用紫外检测仪检测蛋白质洗脱峰。体合并(125I2Fg)冻存备用。以纸层析法鉴定125I2125I2Fg的化学纯度。11212125I2016mL新鲜人抗凝全血、富血8小板血浆r m20min,血小板计数>4×10 mL)或无血小板血浆(抗125凝血经5rmin离心20min),再加入20LI2Fg(约37kBq)和50L0.5mol LCaCl2(含5U牛凝血酶)混匀后即吸入内径012cm、长10cm的聚乙烯塑料管内,置37水浴温育30min,形成冻胶状后吹入生理盐水中,然后切成约015cm长的栓子,每次用30mL生理盐

6、水振荡清洗,连续洗5次,每次5min,清洗后每个栓子浸在1mL生理盐水的测量管内,使用前用LKB21282闪烁计数器测量其放射性活度。2结果211125I-Fg鉴定125从纸层析法分析制得的125I2Fg的放射性浓度达到11GBq L,并保持良好生物活性。I2125125Fg的柱层析分离结果示于图1。将919号收集溶液合并,即为I2Fg产品,经过鉴定I2Fg放化纯度>95%,放射性比活度为212GBq g。212125I2纤维蛋白栓子利用新鲜人抗凝全血,富血小板血浆和无血小板血浆分别与125I2Fg混合,在Ca2+参与下经凝血酶作用将纤维蛋白原分解成纤维蛋白单体,单体纤维蛋白聚合形成冻胶

7、状栓子。新鲜全血制成的栓子呈鲜红色、有弹性;富血小板血浆栓子呈乳白色、有弹性,生理盐水浸洗不改变体积,与天然血栓一致。无血小板血浆栓子呈半透明胶状,质地较软,生理盐水浸泡减少体积。由于凝血酶分解纤维蛋白原速度快,部分125I2Fg来不及转变成125I2纤维蛋白,反应溶液便成胶冻状中断反应,因此,栓子中125I2Fg的清洗十分重要,125I2纤维蛋白栓子每次清洗出的放射性占栓子总125I2Fg放射性的百分比示于图2。由图2可知,经过第一次清洗,几乎50%125I2Fg被清除,经过5次清洗后,清洗液的放射性相当于本底水平,这样125I2纤维蛋白栓子参与溶栓反应时,计算出的溶栓效率才具有真实性。21

8、3体外溶栓反应体外溶栓为类天然栓子在纤溶酶作用下生成可溶性多肽的反应过程。正常血浆纤溶酶以无活性的酶原形式存在,必须有溶栓剂的参与才能实现溶栓反应。实验观察了含有100kU L重组葡激酶的富血小板血浆中全血、富血小板和无血小板125I2纤维蛋白栓子,在37水浴振荡保温至4h的溶栓反应,结果示于图3。图3表明富血小板血浆与无血小板血浆有较大差异,富血小板血浆明显优于无血小板血浆。栓子也以富血小板栓子为优,富血小板栓子反应1h后就接近高峰,无血小板栓子反应2h后才接近高峰。在体外溶栓中选择富血小板栓子和富血小板血浆为最佳,反应时间选择1h即可。202214温度对溶栓的影响同位素第11卷实验选择4、

9、20和37三个温度段,观察富血小板栓子在含100U mL重组葡激酶的富血小板和无血小板血浆中的溶栓规律,结果表明温度对溶栓反应影响较大,4和20温育溶栓反应缓慢,而富血小板血浆中溶栓反应则呈较高的速度,1和2h溶栓率显著高于无血小板血浆。37时富血小板和无血小板血浆溶栓反应速率相当,均呈现快速反应,各时相点的溶栓率均显著地高于4和20(P<0.001)。215溶栓剂STAR和SK溶栓效果测定重组葡激酶(STAR)(),它60U和600USTAR及20图4表明STAR和SK都有良好的溶栓效果,且溶U和200,4。,这一结果与文献10报道一致。图1125I2Fg柱层析分离谱1280nm吸收;

10、2放射性活度图2125I2栓子放射性洗脱结果图3不同栓子在不同血浆中溶栓比较全血;富血小板栓子;无血小板栓子;富血小板血浆;-无血小板血浆图4STAR和SK溶栓效果比较1STAR600U;2STAR60U;3SK200U;4SK20U;5对照第4期杨熠等:体外溶栓放射分析方法2033讨论血管内血流的局部凝血系统的激活,使部分纤维蛋白原水解成纤维蛋白,单体纤维蛋白聚合包裹部分血液成分形成血栓,溶栓是血栓溶解的过程。正常机体具有良好的纤溶体系,能及时将血栓清除。当纤溶能力低下时,小血栓随循环不断增大,阻塞血管便发生血栓病,这时必须借助于体外注入溶栓剂,促使血栓水解,恢复血流。究手段。图3,、白细胞

11、吸附125I2纤维蛋白水解产物,反应母液,在使用这一方法,解决了模拟体内血,特别是血栓病易感因素的调查分析提供了特异灵敏的手段,。参考文献1李怀芬,牛惠生1组织纤维蛋白溶酶原激活剂对血栓溶解作用的实验研究1中华核医学杂志,1991,11(2):12212李怀芬,牛惠生1纤溶酶原放射酶分析1同位素,1997,10(1):1213李怀芬,牛惠生1纤溶酶原激活剂放射酶分析1放射免疫学杂志,1996,9(6):32114LoscalzoJ,WeinfeldM.Lipoprotein(a)FibrinBindingandPlasminogenActivation.Arteriosclerosis,199

12、0,10:240.5PannellR.AComparisonoftheRatesofClotlysisinaPlasmaMilieuInducedbyTissuePlasminogenAc2tivator(t2PA)andRec2pro2urokinase:EvidenceThatt2PAHasaMoreRestrictedModeofActionFibri2nolysis,1992,6:1.6SatoshiK.InhibitionofClotlysisandDecreasedBindingofTissue2typePlasminogenActivatorasaCon2sequenceofCl

13、otretraction.Blood,1992,79(6):1420.7RobbieLA,BennettB,CrollAM.Hamostats,1992,75:127.8TakadaA,TakadaY,UranoJ.PhysiologicalAspectsofFibrinolysis.ThrombResearch,1994,76:1.9StassenTM,VanlinthoutI,LijnenHR,etal.HamsterPulmonaryEmbolismModelfortheEvaluationoftheThrombolyticandPharmacokineticPropertiesofTh

14、rombolyticAgents,Fibrinolysis,1990,4(Sup2.2):15.pl10CollenD,WerfFV.CoronaryThrombolysisWithRecombinantStaphylokinaseinPatientsWithEvolv2ingMyocardialInfarction.Circulation,1993,87(6):1850.ProteinsofFibrinolyticSysteminHumanThromb.iThromb204同位素第11卷THEMETHODOFTHROMBOLYTICRADIOASSAYINVITROYangYiNiuHuis

15、hengLiHuaifenZhaoZhuanyouWangYinlanLiuHouxiao(TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,StatePharmaceuticalAdministrationofChina,Tianjin300193)(ChineseAcademyofMedicalSciences,InstituteofRadiationMedicine,T300192)ABThesimilarnaturethsmIlatelet2richorantithrom2boticbloodcupmaandthrombolyticagent.Theth

16、rom2bolyticontheradioactivityofplasma.Atthesametime,somerelativerswiththrombusandthrombolyticeffectsofrecombinantstephylokinase(STAR)isdiscussed.Theseresultsshowthatradioassaytechnologyissensitive,stable,specificandwonderfulmethod.Keywordsthrombodiseasethrombolyticagentradioassay核科技及相关领域获何梁何利奖简况何梁何利

17、基金是一项民间科技奖励基金,是由香港何善衡基金会有限公司、梁钅求琚博士、何添博士、利国伟先生之伟伦基金有限公司各捐资1亿港元于1994年3月30日在香港注册成立的科技奖励基金,冠以四位金融家的姓氏,称为何梁何利基金。在核科学与技术领域工作或与核科技相关并为核科技发展作出重大贡献的我国科学家获奖情况如下所列:王淦昌科学与技术成就奖中国核工业总公司黄旭华技术科学奖中国船舶工业总公司七院彭桓武科学与技术成就奖中国科学院理论物理所周毓麟数学奖中国工程物理研究院朱光亚科学与技术成就奖全国政协冯端物理学奖南京大学王鸿祯地质学奖中国地质大学黄祖洽物理学奖北京师范大学王大中技术科学奖清华大学胡聿贤地球科学奖国家地震局地球物理所胡仁宇物理学奖中国工程物理研究院陈学俊技术科学奖西安交通大学陈能宽技术科学奖中国工程物理研究院物理学奖中国科学院高能物理所陈家镛技术科学奖中国科学院化工冶金所谢家麟物理学奖中国科学院高能物理所胡思得技术科学奖中国工程物理研究院涂光炽地球科学奖中国科学院地学部彭士禄技术科学奖中国核工业总公司欧阳予技术科学奖中国核工业总公司方守贤物理学奖中国科学院高能物理所汪德昭物理学奖中国科学院声学研究所赵仁恺技术科学奖中国核工业总公司何泽慧(女)物理学奖中国科学院高能物理所钱绍钧技术科学奖中国人民解放军总装备部赵忠贤物理学奖中国科学院物理研究所徐至展技术科学奖中国科