叶酸受体介导的靶向给药研究进展

1、叶酸受体介导的靶向给药研究进展林凤云综述朱照静*审校(重庆医科大学药学系药剂学教研室,重庆400016摘要:叶酸受体可以与叶酸及其类似物特异性结合,通过介导细胞内化将其摄入细胞胞浆。利用叶酸受体在肿瘤和关节炎细胞的过度表达,使药物与叶酸结合,以叶酸受体为作用靶点,即可将药物主动靶向肿瘤和关节炎细胞,从而提高药物在肿瘤、关节炎的组织分布,达到靶向诊断、治疗的目的。本文就叶酸受体及其组织分布,叶酸受体介导的内吞作用,叶酸受体介导的肿瘤和关节炎的靶向诊断、治疗的研究进展进行了综述。关键词:叶酸;叶酸受体;靶向;肿瘤;关节炎中图分类号:R94文献标识码:A文章编号:1001-0971(200603-0

2、178-04收稿日期:2005-11-09*通讯作者:朱照静,男,教授,硕士生导师,研究方向:药物新剂型1986年自发现叶酸(folic acid ,folate ,FA 是由受体介导的内吞途径进入细胞以来,人们开始对FA 作为靶向载体进行深入研究。现已证实在肿瘤、关节炎部位有高表达的叶酸受体(folate receptor ,FR ,对FA 及FA-药物复合物具有高亲和力,通过内吞作用可将药物转运至细胞内。以FA (或其类似物为配体,从小分子放射性显像剂到大分子基因药物都可与FR 高效结合,并被转运进入细胞。本文将FA 作为靶向载体的作用机制及其在肿瘤、关节炎诊断和治疗方面的应用进行综述。1

3、叶酸受体及其组织分布FA 是人体必需的维生素,但人体不能合成FA ,需摄取外源性FA 。其摄取途径是FA 通过与细胞表面的FR 结合,内吞进入细胞。由此,人们推测在细胞增殖较多、分裂较快的组织,需要大量的FA ,由此推测FR 应高水平表达。实验证实,FR 是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白,相对分子质量(M r 为3840ku ,主要有3种亚型:-FR 、-FR 和-FR 。FR 在正常组织中的表达高度保守,只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低到中等水平表达,以-FR 为主。而在大部分恶性肿瘤中FR 具有高度表达(表11,2,有时可比正常组织高出100300倍。-FR 在一些上皮细胞系肿瘤,如卵巢

4、癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌等高水平表达;-FR 在乳腺癌、脑瘤、睾丸癌、头颈部肿瘤、粒细胞白血病等高水平表达;-FR 在组织中难以检测3。转移瘤的FR 比原位、恶性程度低的肿瘤表达更多。此外,在关节炎的活性滑液巨噬细胞上-FR 也有大量表达,而在休眠的巨噬性细胞上不表达。表1叶酸受体在肿瘤中的表达肿瘤新发病人(例FR 过表达率(%卵巢癌2330093%脑瘤1700075%子宫内膜癌3930091%肾癌3180043%头颈部肿瘤2890038%肺癌16940037%乳腺癌20500032%间皮组织癌250073%结肠直肠癌1520022%2叶酸受体介导的内吞作用FR 对FA 及其

5、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸等叶酸类似物具有很高的亲和力(K D 10-10mol L -1和特异性,可介导这些物质内吞进入细胞,它是生物细胞最具有特点的转运过程之一。因此,人们利用FR 对FA 及其类似物的转运机制和FR 在肿瘤及关节炎巨噬细胞的高度表达,对肿瘤和关节炎的特异性显像诊断及治疗进行研究。将放射性核素、抗肿瘤药物及基因药物与FA 或FA类似物偶联,通过FR介导进入靶细胞内,对疾病进行诊断和治疗。其转运过程如图1所示4:外源性的FA-药物复合物与细胞膜表面的FR特异性结合,FA-药物/FR复合物周围形成凹陷,在细胞内形成内涵体,在核

6、内体膜质子泵的作用下,内涵体内pH由7降至5,使FA-药物/FR复合物的构象改变,药物从复合物上解离,药物被释到细胞内,而FR 可再回到细胞膜表面,循环转运药物。图1FR介导的内吞作用过程3叶酸受体介导的肿瘤诊断人们对FR介导的诊断显影剂包括放射性核素、荧光染料、磁共振(MRI成像剂和正电子发射计算机断层(PET显影剂等进行了研究,但是只有放射性核素取得了一定的成功,已进入了临床5。因此,本文将主要介绍放射性核素的应用。FA及其类似物通过羧基与放射性核素偶联形成显影剂,可与FR特异性结合,选择性浓集于FR 表达丰富的组织。由于FR在肿瘤和非肿瘤组织的分布有显著性差异,因此,FR介导的显影剂可获

7、得肿瘤与正常组织高对比度的图像,以此对肿瘤进行定位、诊断及评价化疗效果。目前,用于显影的放射性核素主要有铟(111In、镓(67Ga、锝(99m Tc和铜(64Cu。核素-FA偶联显影剂在体内表现出明显的肿瘤特异性,当显影剂与FA同时给药时,摄取被竞争性抑制,说明显影剂是通过FR介导进入肿瘤细胞,而非特异性结合很少。不同显影剂在肿瘤与非靶组织的浓度比值如表2所示3,6,7。表2各种显影剂在肿瘤与非靶组织浓度比值肿瘤/非靶组织67Ga-DF-FA111In-DTPA-FA99m Tc-HYNIC-FA99m Tc(CO367Ga-DF-FA:67镓-去铁胺-叶酸盐;111In-DTPA-FA:1

8、11铟-二乙三胺五乙酸-叶酸盐;99m Tc-HYNIC-FA:99m锝-肼基烟酰胺-叶酸盐;99m Tc(CO3-DT-PA-FA:三羰基99m锝-DTPA-叶酸盐Ke等6,8,9的研究表明,111铟-八齿-二乙三胺五乙酸-叶酸盐(111In-octadentate-DTPA-FA、111铟-二乙三胺五乙酸-乙基二氧-双乙胺-蝶酸盐(111In-DTPA-NOON-pteroate、99m锝-二乙三胺五乙酸-叶酸盐(99m Tc-DTPA-FA和99m Tc-半胱氨酸-天冬氨酸-二氨基丙酸-D-谷氨酸-蝶酸盐(99m Tc-EC20的肿瘤/非靶组织分布情况与111In-DTPA-FA基本相同

9、,都具有肿瘤选择性。对67Cu-FA偶联物作为显影剂虽然进行了研究,但目前尚未获得理想的结果。目前,在FR介导的肿瘤诊断试剂中,仅111In- DTPA-FA(即FolateScan完成了期临床试验,在35例卵巢癌患者中正确检出率为82%10。4叶酸受体介导的肿瘤治疗4.1叶酸-硼化合物硼中子捕获疗法(BNCT是目前新兴的一种肿瘤治疗方法,其原理是用热中子轰击硼(10B同位素,产生粒子和Li+离子。这两种粒子将在组织内产生10m范围的射线,因此,细胞损伤只会发生在有10B摄入的组织内。BNCT治疗肿瘤的关键是要将10B特异性转运入肿瘤细胞,减少正常组织的损伤。Sudimack等11以卵磷脂、聚

10、乙二醇(PEG、二硬酯酰乙醇胺(DSPE制备了脂溶性硼剂Knido-7-CH3(CH215-7,8-C2B9H11的叶酸-聚乙二醇-二硬酯酰乙醇胺(FA-PEG-DSPE和聚乙二醇-二硬酯酰乙醇胺(PEG-DSPE脂质体,细胞培养显示,KB细胞对靶向和非靶向脂质体摄取量分别为587g10B10-9个细胞和42.9g10B10-9个细胞。4.2转运细胞毒性药物细胞毒性药物在对肿瘤进行化疗时,常因药物不能在肿瘤部位达到有效浓度而导致化疗失败,同时也会增加毒副作用。FA及其类似物与细胞毒性药物偶联,可将药物靶向浓集于肿瘤组织,对肿瘤进行特异性治疗,改善药物的治疗效果。Ladino等通过二硫键将美登醇

11、与FA偶合,形成FA-美登醇复合物,可对高表达FR的细胞株(如SK-OV-3,LoVo,HeLa,SW620和KB细胞等有选择性杀灭作用(IC50=10-1010-11molL-1。Aronov等12制备的FA-PEG-Pt复合物,与FR阳性的M109细胞孵化时,可明显提高铂(Pt在细胞内的浓度。Paran-jpe等13合成了喜树碱(CPT的FA复合物,可将CPT的毒性增加16倍。Yoo等14将FA和多柔比星(DOX分别连接在PEG链的-和-端,形成的DOX-PEG-FA,对KB细胞毒性(IC50=5.6molL-1比DOX(IC50=9.8molL-1高。对荷瘤裸鼠尾静脉注射23d后,给予D

12、OX-PEG-FA裸鼠的肿瘤体积比给予DOX的明显减小(40%,结果表明具有靶向性。4.3转运基因药物Kim等15采用FA载体技术,制备了基因药物绿色荧光蛋白小干扰RNA质粒载体-乙烯亚胺-聚乙二醇-叶酸盐(pSUPER-siGFP-PEI-PEG-FA,在GBF-KB细胞上的基因沉默效率为90%,而没有FA载体的绿色荧光蛋白小干扰RNA质粒载体-乙烯亚胺-聚乙二醇(pSUPER-siGFP-PEI-PEG却不超过40%,表明FR可介导基因转运方面的优势。Yang等16合成的反义表皮生长因子受体寡聚核苷酸(antisense-EGFR-ODN-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸盐(DSPE-PEG-

13、FA与KB细胞共同培养1h 后,噻唑蓝(MTT比色分析结果表明,对KB细胞生长的抑制率达50%,而非FA介导的仅为10%;延长培养时间也得到相同结果。4.4免疫治疗由于肿瘤相关抗原(TAA与正常蛋白相差很小,宿主免疫系统的细胞、体液免疫不能识别肿瘤细胞,从而不能进行正常免疫应答,逃避在体内被杀灭。为了达到免疫治疗的目的,可采用外来半抗原修饰肿瘤分子,提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。同时可利用抗体依赖细胞介导的细胞毒药物,增加杀死肿瘤细胞的能力。FR在肿瘤细胞高度表达,可作为外来半抗原修饰肿瘤的靶点。Lu等17在BALB/c小鼠腹腔内植入5106FR 阳性的M109肺癌细胞,并用钥孔血蓝素

14、-异硫氢酸荧光素(KLH-FITC免疫,肿瘤移植4d后,每周给予FA-异硫氢酸荧光素(FA-FITC1800nmolkg-1治疗,结果小鼠存活率比仅给予磷酸盐缓冲溶液(PBS的对照组显著增加。接着Lu等17又在接种L1210A白血病细胞的DBA小鼠模型上作进一步的研究,接种后的第7,8,9,11和14天给予FA-FITC (1800nmolkg-1、细胞因子IL-2(250ku和IFN-(75ku,结果FA-FITC可与细胞因子协同作用,明显提高荷瘤动物的存活率。5叶酸受体靶向关节炎关节炎可引发体内免疫应答,刺激活性巨噬细胞的生成,而FR在活性滑液巨噬细胞有高度表达,提示可利用FR对关节炎进行

15、选择性诊断和治疗。Turk等18以佐剂性关节炎小鼠为模型,考察了FA-EC20的靶向性。闪烁扫描法显示,关节炎小鼠足部有EC20聚集,但健康小鼠没有聚集。关节炎小鼠肝和脾对EC20的摄取均有所增加,可能是由于炎症激活了肝脾组织的巨噬细胞,FR表达相应增加。游离的FA可减小组织的图像密度,说明FA-EC20利用FR将放射性药物或治疗药物靶向佐剂性关节炎的巨噬细胞是可行的。Chen等19设计了一种近红外荧光标记的FA探针(NIR2-FA,并以小鼠关节内注射脂多糖(LPS造模,测定其荧光信号。LPS诱导踝关节炎症后48 h,分别静脉给予NIR2-FA及对照试剂游离荧光染料(剂量每只为2nmolL-1

16、,荧光信号检测结果表明NIR2-FA在炎症部位的分布显著增加。先给予600倍的叶酸(每只1.2molL-1,5min后再注射NIR2-FA时,观察到FA竞争性抑制NIR2-FA在炎症关节部位的分布,增强比下降到1.1。表明FR介导的近红外荧光探针可特异性结合到关节炎炎症部位。因此,可用于关节炎的诊断。Paulosa等20运用FR介导肿瘤免疫治疗原理,对路易鼠足垫注射热灭活支原体诱导关节炎,以钥孔血蓝素半抗原(免疫后,腹腔内注射FA半抗原复合物(FA-EDA-FITC500nmolL-1kg-1,注射时间分为诱导后1,4,7,10,13,16,19d,以数字测径器测定关节大小,结果表明,FR介导

17、的关节炎免疫疗法可明显改善关节炎的症状,使发炎肿胀下降约30%。6结语近年来,配体-受体靶向转运系统已经成为新药研发的重点。与其他配体相比FA具有显著优势: M r小、稳定性好、无免疫原性、价格便宜、易于制备、与FR亲和力高;同时它的应用空间更广,可用于FR+肿瘤和炎症性疾病的诊断、治疗。但是,FR介导的靶向给药研究,目前大多数仅处于实验研究阶段,临床试验尚需进一步研究。寻找更好的标记显像剂的方法,性能更佳的双功能螯合剂;研究适合高效的制备FA复合物的方法、提高FA药物复合物的稳定性、体内靶向性等是今后要解决的主要问题。FR介导的靶向转运已经在肿瘤、关节炎的靶向诊断和治疗上显现出独特的优点,是

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