首批还原型谷胱甘肽杂质国家对照品的研制

1、首批还原型谷胱甘肽杂质国家对照品的研制王 悦 , 郝苏丽 , 杨化新 , 范慧红 (中国药品生物制品检定所 , 北京 100050摘要 : 目的 建立首批还原型谷胱甘肽中氧化型谷胱甘肽杂质对照品 。 方法 以茚三酮试验进行鉴别 , 应 用液质联用仪 、 红外光谱仪对氧化型谷胱甘肽进行结构确证 , 反相高效液相色谱法使用 2种流动相体系进 行纯度测定比较 , 用质量平衡法计算含量 。 结果 确证了氧化型谷胱甘肽原料的结构 , 并确定首批氧化型 谷胱甘肽对照品含量为 93 6%。 结论 首批氧化型谷胱甘肽国家对照品 (批号 :140746 200801 的建立方 便了还原型谷胱甘肽中氧化型谷胱甘肽

2、杂质的定性和定量控制 。关键词 : 谷胱甘肽 ; 氧化型谷胱甘肽 ; 对照品 ; H PLC中图分类号 :R915 文献标识码 :A 文章编号 :1002 7777(2010 03 0248 03Standardization of the National Reference Standard of the Impurity of GlutathioneWang Yue, H ao Suli, Yang H uax in and Fan H uiho ng (Natio nal Institute for the Co ntro l of Pharm aceutical and Biolog

3、 ical Products, Beijing 100050ABSTRACT: Objective To establish the natio nal reference standard fo r o xidized g lutathio ne (GSSG. Methods LC M S and IR Spectrometer w ere used to confir m the structure o f the m aterial. Tw o m obile phases w ere used to determ ine the purity of ox idized g lutath

4、io ne by H PLC, and the content of the product w as calculated by mass balance m ethod. Results T he structure o f the material has been confirm ed, and the content of o xidized glutathione w as 93 6%.Conclusion T he establishm ent of national refer ence standard o f ox idized glutathione can effici

5、ently contr ol the quality and quantity of o xidized g lutathione in g lutathione. KEY WORDS: g lutathione; o xidized g lutathione; natio nal reference standard; H PLC还原型谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨 酸结合而成的三肽 , 属于含有巯基的小分子肽类物 质 , 在生物体内有着重要的作用 , 具有抗氧化、清 除自由基、解毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌等 功效 , 是重要的功能因子 1, 在临床上用于放疗及 化疗患者、各种低氧血

6、症、肝脏疾病 , 亦可用于有 机磷、胺基或硝基化合物中毒的辅助治疗。国内现 有 7个厂家生产谷胱甘肽及其制剂。氧化型谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽及制剂中最 主要的杂质 , 是由 2个还原型谷胱甘肽以二硫键结 合的产物 , 氨基酸序列 :该杂质含量的控制一直以来都使用还原型谷胱 甘肽自身对照法 2 3, 由于自身对照法不能对杂质 定性 , 若样品中有关物质成分复杂时 , 就为氧化型 谷胱甘肽的定性及定量带来了较大困扰 , 因此迫切 需要氧化型谷胱甘肽对照品的研制。1 仪器与试药Waters 液相色 谱仪 (1525泵 , 2487检测器 , 717plus 自 动 进 样 器 , EM POWER

7、工 作 站 ; Mettler T oledo 电子天 平 ; WRB 1B 数字熔点仪 ; FEB 115精 密烘 箱 ; M ettler To ledo MP230酸 度 计 ; Thermo Nico let NEXU S FTIR 红 外光 谱仪 ; Finig an LCQ DECA XP Plus 液质联用仪 ; Perkin Elmer M odel 343Plus 旋光仪。氧化型谷胱甘肽原料 (北京欣经科生物技术有 限公司购买 , Sig ma 公司 生产 , CAS 27025 41 8 ; 茚三酮、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、庚烷磺 酸钠和磷酸均为分析纯 ; 甲醇为色谱纯 ;

8、 还原型谷 胱甘肽对照品 (中国药品生物制品检定所 , 批号 :248中国药事 2010年第 24卷第 3期作者简介 :王悦 , 研究实习员 , 硕士研究生 ; T el:(010 67095305; E mail:w angyu ejoygmail com140706 200702 。2 方法与结果2 1 性状为白色冻干粉末。2 2 鉴别2 2 1 化学 鉴别 取待 标品 适量 , 加 水制 成约 1m g mL 1的溶液 , 加入茚三酮试液 1滴 , 加热 , 溶液由淡黄色变为蓝紫色。2 2 2 H PLC 法鉴别2 2 2 1 磷酸盐缓冲液系统 RP HPLC 纯度分析 2色谱 柱 :S

9、ymm etry Shield RP 18(4 6m m 150mm, 5 m ; 流动 相 :0 025m ol L 1磷 酸二 氢钠溶液 (用 磷酸 调节 pH 值 至 3 15 ; 检 测波 长 :220nm 。将还原型谷胱甘肽对照品和氧化型谷 胱甘肽待标品用流动相制成约 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色谱仪 , 记录色谱图见图 1、图 4。待标 品溶液主峰保留时间为 5 072m in, 对照溶液主峰 保留时间为 2 949m in, 主峰后最大杂质峰保留时 间为 5 080min, 分离度为 3 23。2 2 2 2 庚 烷磺酸钠溶 液系统 RP HPLC 纯度 分 析 3色谱

10、 柱 :Symm etry Shield RP 18(4 6m m 150mm, 5 m ; 流动相 :0 01mo l L 1庚烷磺酸 钠溶液 (取庚烷磺酸钠 2 2g 和磷酸二氢钾 6 8g, 加水 1000mL 溶解后 , 加磷酸调节 pH 值至 3 0 甲醇 (97! 3 为流动相 ; 检测波长 :210nm, 将 还原型谷胱甘肽对照品和氧化型谷胱甘肽待标品用 流动相制成约 1mg mL 1的溶液 , 注 入液相色谱 仪 , 记录色谱图见图 1、图 5。待标品溶液主峰保 留时间 为 9 618min, 对照 溶 液 主峰 保 留 时间 为 4 196m in, 主 峰 后 最 大 杂

11、质 峰 保 留 时 间 为 9 701m in, 分离度为 7 58。a 磷酸盐缓冲液系统 ; b 庚烷磺酸钠溶液系统。图 1 还原型谷胱甘肽对照品色谱图2 3 结构确证2 3 1 红外光谱法 采用溴化钾压片 ; 待标品扫 描次 数 为 32; 背 景 扫 描 数 32; 分 离 度 4 000; sam ple g ain 1 0; mirr or velocity 0 6329; Aper ture 100 00。红外图谱与标 准图谱 (Spectr al Database fo r Or ganic Co mpo unds, SDBS No :11258 基本一 致 , 见图 2 。图

12、2 待标品红外光谱图2 3 2 质谱法 称取待 标品 , 加水制 成 10 g mL 1的溶液。离子源 :ESI 源 ; 源电 压 5KV; 毛 细管电 压 15V; 鞘气流速 40arb; 辅助气流速 5arb; 透镜电 压 30V; 扫描方式 :负离子全扫描 ; 进样 :流动注 射进样 30 L m in 1。氧化型谷胱甘肽分子式为 C 20H 32N 6O 12S 2, 相 对分子量为 612 63, 经 H PLC M S 分析测得 其准 分子离子峰 M H -为 611 0, 因此其相对分子质 量为 612 0, 与理论值一致 , 见图 3 。图 3 待标品质谱图2 4 检查2 4

13、1 干燥 失重 105 干燥至 衡重 , 减失 重量 4 5%。2 4 2 比旋度测定 待标品用水配成 40mg mL 1, 20D = 97 5#。2 4 3 熔程 数字熔点仪预置温度为 145 , 调 节升温 速 率 为 1 min 1, 测 得 待 标 品 熔 程 为164 6166 7 。2 4 4 纯度分析磷酸盐缓冲液系统 RP H PLC 纯度分析。方法 同 2 2 2 1%。将待标品用 流动相制成 约 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色谱仪 , 见图 4, 用 H PLC 系统工作站对结果进行数据处理 , 用面积归一化法 计算出其纯度 , 结果为 98 03%(n =4 。图

14、 4 磷酸盐缓冲液系统 R P H PL C 色谱图(下转第 297页 a 对照品 ; b 样品 ; c 水杨酸 ; 1 阿司匹林 ; 2 水杨酸。图 1 阿司匹林肠溶片 H PL C 色谱图3 讨论由表 2可见 , 2种测定方法的结果差最高可达 40%。在实验过程中 , 我们根据液相色谱图中测得的供试品溶液中水杨酸的含量 , 在阿司匹林对照品 溶液添加一定量水杨酸对 照品 , 使水 杨酸浓度为 2 5mg L 1, 然后测定添加 前后阿司匹林对照品 溶液的吸光度 , 结果吸光度的变化在 5%左右 , 这 说明水杨酸不是影响紫外分光光度法测定结果严重 偏高的主要因素。不同的厂家使用的不同辅料

15、, 导 致了紫外分光光度法测定结果相对于真实释放量不 同程度的偏离 , 影响了实验者对阿司匹林肠溶片真 实释放量的判断。另外 , 用紫外分光光度法测定阿司匹林肠溶片 在缓冲液中的释放度 , 其吸光度读数仅为 0 2左右 , 而供试品溶液的吸光 度以在 0 30 7为宜 , 超出此范围 , 会产生较大的误差 , 使结果不准确 , 所以紫外法不符合定量分析的要求。经比较 , 高效液相色谱法灵敏、准确、专属性 强 , 更适用于小剂量阿司匹林肠溶片在缓冲液中释 放量的测定。 参考文献 :1中国药典 S 二部 , 2005:284 2842国家药品标准 S WS 10001 (HD 0614 2002,

16、 2002 3何英梅 , 贺军权 小剂量阿司匹林肠溶片含量测定方法商榷 J 中国药事 , 2005, 19(2 :25 264赵爱萍 , 魏晓慧 , 丁太刚 H PL C 法测定小剂量阿司匹林肠 溶片含量 J 中国药师 , 2007, (4 :56 57(上接第 249页 庚烷磺酸钠溶液系统 RP H PLC 纯度分析。色 谱柱 :方法同 2 2 2 2%, 将待标品用流动相制成约 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色谱仪 , 记录色 谱图 , 用 H PLC 系统工作站对结果进行数据处理 , 用面积 归一化 法计算 出其 纯度 , 结果 为 99 60%(n =3 , 见图 5。 图 5

17、庚烷磺酸钠溶液系统 RP H PL C 色谱图3 讨论&中国药典 、 &美国药典 、 &英国药典 、 &欧 洲药典 及 &日本药局方 对该化合物均无收载。基于纯度方面的考虑 , 我们选择的待标品原料 为 Sigm a 公司生产的氧化型谷胱甘肽。熔程 测定 结 果 显 示 , 该 批 待标 品 的 熔 程 为 2 1 , 熔程稍长 , 可能与样品中杂质有关。 纯度使用了 2种流动相体系进行了分析 , 由图 3和图 4可见 , 还原型谷胱甘肽对照品在庚烷磺酸 钠溶液体系中的保留时间和杂质检出方面优于磷酸盐缓冲液体系 , 但用该系统分 析氧化型谷胱 甘肽 时 , 峰形对称性较差 , 主峰前 沿 (图 6 , 且 杂质 检出率较低 , 故纯度以磷酸盐缓冲液体系测定结果 计 , 为 98 03%。氧化型谷胱甘肽在庚烷磺酸钠溶液体系中虽然 峰形前沿 , 但主峰保留时间较磷酸盐缓冲液体系理 想 , 今后可以更换色谱柱进行进一步摸索工作。由于氧化型谷胱甘肽国际上尚无对照品 , 经研 究 , 含量使用