运动对老鼠心肌影响调节作用

1、运动对老鼠心肌影响调节作用     运动心脏的发生机制是运动人体科学研究的热点，随着分子生物学技术的发展，相关研究日趋深入。运动心脏的形成不仅是血流动力负荷所引起的细胞体积和结构的改变，神经体液因素还通过各类信号传导，调节初始应答和次级应答基因转录，引起心肌细胞、的翻译合成，形成心脏肥大机制。近年来发现，（）具有多种心脏特异表达类型，可调节动物心脏生长和发育，影响疾病及环境适应相关基因表达，对心脏重塑适应中的信号通路具有调节作用。是一类长约非编码，在转录后水平调节基因表达，具有高度保守性、基因簇集排列和组织表达特异性等特点，广泛存在于真核生物细胞中，是最

2、大的基因家族之一，大约占整个基因组的。通过与目标的非翻译区互补配对，对进行切割或抑制，大多情况下，与靶目标进行非精确互补，对翻译进行抑制，降低蛋白表达。近年关于的研究已成为热点研究领域。在心脏发育和功能变化中起到重要调节作用，涉及的信号通路参与了心肌肥厚的发生，如、通路。研究较多的是、，发现和在小鼠和人体的心肌肥大中起调节作用，离体实验中，过表达、明显抑制心肌肥大；而心肌肥大模型小鼠和的表达量均明显下调，还发现体内抑制表达则诱导心肌肥厚，、抑制心肌肥厚可能通过抑制促心肌肥厚靶基因（如、）有关。而等进一步发现，敲除小鼠的或，抑制成熟生成，会发生扩张性心肌表现，认为的缺失，导致和两种转录因子含量增

3、加，最终增强成肌细胞的增殖。此外，有研究发现，和分别定位于（）基因内含子和（）基因内含子，这两种对心脏的肥大也起促进作用，通过调节和的比例影响心脏形态结构及功能，引起心脏肥大。本文通过文献分析筛选出影响小鼠心脏肥大的几个关键，考察不同负荷游泳运动对、的影响，重点了解长期运动后心脏变化情况，探索部分运动心脏形成的分子机制。材料与方法实验动物与分组周雄性小鼠只，平均体重为±，由河北联合大学动物实验中心提供。实验室动物房常规饲养，小鼠购入后适应性喂养周，饲料为标准普通饲料，自然光照，自由饮食、饮水，分笼饲养。随机分为组，每组只，为安静对照组（，组）、一次性力竭运动组（，组）、周耐力训练组（

4、，组），运动前各组间小鼠体重无显著性差异。动物运动模型组进行无负重游泳训练，游泳水槽（××），水深，水温，适应期内组小鼠适应性游泳训练天。然后，正式开始周训练，每周训练天，前周，每天晚间运动次，后周每天运动两次，间隔；第周每次运动，从第周起每周增加直至，最后两周均维持在，最后训练阶段发现个别小鼠动作协调性下降、下沉明显时，将其取出休息，再放入池中继续运动，运动结束后迅速吹干毛发，放置鼠笼；组小鼠进行一次力竭性运动，没于水下达时，仍无法自主返回水面视为力竭；组不进行任何运动。组织取样及称重组在最后一次训练结束后取材，组力竭后即刻与组同时取材。先称体重（），小鼠迅速引颈处死，取

5、完整心脏并进行修剪，将心脏沿冠状面切开，滤纸吸干心脏表面的液体后称重心脏（），迅速放入液氮速冻，于低温冰箱保存待用。心脏超声心动图测定方法训练最后一周，全部小鼠腹腔注射饱和三溴乙醇（用量）麻醉后，仰卧位固定于操作台上，高分辨小动物超声仪（型，公司），宽频探头（），频率，聚焦深度，采集小鼠心脏的二维、型超声心动图像，测量评价心脏结构和功能的各项参数。本次研究选用指标有舒张期心室隔膜厚度（）、收缩期心室隔膜厚度（）、舒张期心室后壁厚度（）、收缩期心室后壁厚度（）、左心室舒张末期内径（）。技术检测方法扩增引物采用技术测定心肌、相对表达含量，登陆网站，查阅相关序列，引物由北京博奥生物有限公司合成，管家

6、基因以作为内参，具体引物结构参考表。样本提取用液氮预冷的研钵研磨心肌样本，按每组织加入（公司）提取，严格按照相关提取试剂盒要求操作，并进行琼脂糖凝胶电泳检测质量，通过紫外分光光度计检测样品的比值，确定的纯度。逆转录取利用逆转录引物进行的合成。反应体系中包括，反转录引物，×，混合液（公司），逆转录酶（公司），酶抑制剂（公司），反应条件：，；，；，。反应反应体系包括以下试剂：（内含聚合酶、），通用上游引物（），特异性下游引物（），总反应体积，进行个反应循环，反应条件：变性，；，；，。最后在到范围内温度每升高电脑自动记录一次荧光值，应用实时荧光定量系统（公司）。系统自动测定指标有：检测样品

7、值、值和融解曲线。采用法计算样品相对含量（倍数），代表反应检测到的荧光强度值显著大于背景值的循环数，代表样品值减去同一样品内参基因值得到的差值，代表上述实验样品值减去对照样品的差值。统计学方法数据输入统计软件，采用单因素方差分析（）统计方法分析数据，所有数据以平均数±标准差（±）表示，表示有显著性差异，表示有非常显著性差异。结果小鼠心肌提取及结果纯度：样品，符合实验要求。总量：样品总量，符合实验要求。完整性：经甲醛变性胶电泳检测，样品电泳条带清晰，电泳条带亮度接近，质量符合实验要求（图）。成熟由于很短，需要“加尾”后才能逆转录，本实验反应良好，每个目标基因溶解曲线呈一个波峰

8、，属于特异性扩增，如溶解曲线（图），其余溶解曲线也呈类似特点，扩增曲线也正常，表明本研究引物设计和操作均符合要求。不同运动影响下小鼠超声心动检测结果提取心肌前最后一周进行超声心动检测，发现运动训练对小鼠心脏结构影响明显。各组体重无显著差异，组训练结束后只有体重下降趋势；但组心脏整体重量（）和心脏体重比值（）个指标要显著性高于组和组（）；发现舒张期心室后壁厚度（）、左心室舒张末期内径（）、舒张期心室隔膜厚度（）、收缩期心室隔膜厚度（）个指标，组训练后明显大于组和组（），收缩期心室后壁厚度（）各组无显著差异。总体结果表明，周耐力训练使小鼠心肌呈现肥大变化，而力竭运动后需即刻取材，运动前组的超声心动

9、图和组无差异（表）。不同运动影响下小鼠心肌表达结果不同运动对心肌表达影响显著。组、表达全部显著性高于组（），表明对一次性力竭运动比较敏感，所选取运动后表达即刻升高；组表达各有不同表现，与组比较，、经过周训练后显著性下降（），而显著性提高（），但提高幅度不及力竭性运动，而组相比组无明显提高（表，图，图）。讨论与分析运动训练对小鼠心脏结构的影响心肌肥大是运动训练的结果，是心肌结构功能对环境刺激的适应性反应。研究认为，力量训练和耐力训练等不同运动方对心脏产生的生理性肥大有所不同。本研究考察一次性运动和长时间耐力训练对心脏结构功能有何影响，在次基础上再考察调节心肌肥大的几个关键。国外研究多用游泳运动诱

10、导实验动物心脏肥大。大鼠多见两种运动方案：一种是持续训练周，每周次，每次游泳运动；另一种方案是前周和第一种运动方案一样，但第周开始每天次运动，间隔，第周每天次运动，间隔。两种运动方案均能诱导大鼠心肌肥大，但第二种方案负荷较大，对心肌肥大的效果更加显著。小鼠游泳训练也能诱导心肌肥大，常用如下模型：小鼠每天两次运动，间歇，第天每次运动，随后每天增加，直至，然后，在次基础上再训练天，共计天运动训练，不同研究在此模型上不断改进，最短甚至天就能成功制造小鼠左心室肥大适应，。本文除了探究运动对心脏结构的影响外，还需要了解长期耐力训练影响下的变化，因此，在参考等人的研究模型基础上，进行了改良，将小鼠训练周期

11、延长到周，后周每天运动两次，加大训练负荷。在取材前天进行超声心动图检测，发现周耐力运动对小鼠心脏结构影响显著。训练小鼠心脏整体重量和心脏体重比值两个指标明显高于组（），除了收缩期心室后壁厚度无显著增加外，舒张期心室后壁厚度、左心室舒张末期内径、舒张期心室隔膜厚度、收缩期心室隔膜厚度个指标均明显大于组和组（）。总体结果表明，周耐力训练使小鼠心肌呈现肥大变化，小鼠对本次研究运动负荷比较敏感，能够产生显著性适应变化，尤其左心室内径的显著性增加表明此次心脏肥大符合离心性心脏肥大表现，符合游泳、长跑等项目训练后心脏适应的表现。由于组力竭后需即刻取材，所以，运动前超声心动图规律同组。不同运动影响下心肌特异

12、性、的表达情况及其调节作用的一大特征是组织特异性，根据组织特异性的定义，如果一个器官组织某种表达超过其它组织该平均表达值的倍以上，可认为其属于该器官组织的特异性。肌肉特异性包括、和。目前报道比较多为生肌调节因子对和两大家族成员的转录调控，小鼠号与号染色体基因簇上游增强子处均发现有血清应答因子（）结合位点，在、基因内部也有生肌决定因子家族（）和结合位点，、和能调节的生成；的生成反过来以这些肌肉调节因子为靶目标，进行抑制性调节，从而形成一个负反馈调节环路。是首个被证实特异性表达于动物心肌的。在发育期的小鼠心脏中，过表达引起心肌细胞的增殖受阻，抑制肥大。在成肌细胞中证明的作用是促进肌细胞的分化，家族

13、中的成员组蛋白脱乙酰化酶（）可与结合，抑制肌细胞的分化，而则通过抑制合成间接促进心肌分化，过度表达会引起细胞分化和多核成熟肌管的形成。抑制心肌肥大机制还在探索中。首先认为通过抑制钙调蛋白（）神经钙蛋白（）路径抑制增殖，阻止了、这些转录因子对蛋白基因的诱导作用。体外实验中发现给、和构建荧光素酶报告基因，联合转染后发现明显降低了荧光素酶报告基因的活力，表明等因子具有被识别抑制的保守序列。其次研究表明与胰岛素样生长因子（）存在反馈调节环路，当含量上升，可抑制翻译工作，下降对心肌增殖产生负面影响，而肌细胞内增加，可引起减少并通过激活信号途径引起细胞肥大。而近期研究发现无论是阻止信号途径中的，还是敲除受

14、体，均能明显降低运动诱发的小鼠心肌肥大，有理由相信可通过抑制途径抑制肥大。具有和两种亚型，成熟心肌仅表达。发现无论敲除小鼠还是，由于任何一种亚型都能剪切出成熟的，小鼠心肌发育正常；两者同时敲除，大多死亡，即使存活到成年，最终死于心肌异常肥大或心衰。这种心肌细胞增殖的紊乱一定程度上是的靶基因与过度表达所致，由此可见主要通过抑制等靶目标来维持心肌正常增殖。研究发现，也可以抑制路径，过表达可抑制肥大，联合转染和连接有荧光素酶报告基因的，发现荧光素酶报告基因活力明显下降，而应用抑制表达后能明显减少荧光素酶报告基因活力的下降趋势。另一项研究同样用标记荧光素酶报告基因方法证实可结合到的，过表达显著抑制的表

15、达，阻止苯肾上腺素所诱导的心肌肥大。运动对、调节影响的研究很少，目前少量报道局限于骨骼肌的研究，等人最早研究了重力负荷和骨骼肌的关系，手术切除小鼠腓肠肌和比目鱼肌，使负荷集中于跖肌并构建天的功能性超负荷模型（），诱导跖肌肥大后发现、明显降低。而等人发现，周耐力训练使男性骨骼肌、明显下降，而一次急性运动则明显提高、表达，认为的这种变化有利于骨骼肌结构和功能的重塑适应。基于以上研究基础，本研究选取心肌特异表达的、为指标，探讨其在运动心脏中的作用。相比对照组，发现耐力训练组小鼠、周训练后显著性下降（）；、下降符合预期假设，即、表达下调可放松对一些信号蛋白的“捆绑”，增强、等信号通路，或加强等上游初始

16、信号激素的合成，加速心肌肥大发生中蛋白质的合成，有利于心脏对环境刺激的适应。而且，、表达下降也与本研究发现的心肌肥大相适应，应该是引起心肌肥大的一个因素；同时发现一次性力竭运动能显著提高、表达（），表明一次性大强度运动即刻心肌增殖肥大相关信号蛋白合成会受暂时性抑制。本文没有对、的几个靶目标进行检测，、升高和下降过程中是否伴随靶目标蛋白合成变化还有待研究。结合前人研究表明，无论是骨骼肌还是心肌，长期训练后、下降是适应过程中的共同现象，有利于肌肉产生适应性变化。近期等报道发现，周的游泳训练使雌性大鼠心肌肥大，伴随、表达明显下降，可能参与了左心室肥大适应调节。本文针对小鼠的研究支持上述结论，即游泳耐

17、力训练均降低大鼠、小鼠心肌、的表达。不同运动影响下心肌、的表达情况及其调节作用研究发现，肌球蛋白重链（）内含子转录的对心脏应激肥大起调节作用。由快速肌球蛋白重链（）基因内含子转录，由慢速肌球蛋白重链（）基因内含子转录，两者在末端仅个核苷酸不同。在小鼠心脏，在胚胎时期特异性大量表达，出生后不久，开始向亚型转变，与此同时，大量表达的也开始向转变。的研究使用丙基硫氧嘧啶诱导鼠心脏合成，发现同步上调，而且，变化也和正相关。以上研究提示，这些特殊的转录是随各自的宿主基因同步表达的，并构成基因基因结构单元（单元、单元）。另外研究还发现，转基因高表达可诱导成年小鼠心肌肥大，同时，也诱导大量生成，表明合成增加

18、。但此过程局限在心脏间质纤维化区域，表明诱导心脏肥大不完全依赖于合成增加，可通过其它途径诱导蛋白合成。关于、下游靶基因研究不多，发现肌肉抑制素（）是、的共同靶目标，家族能够结合下游的，减少合成，有利于心肌肥大的发生；此外，还能促进的合成，减少心律失常，在基因全部敲除的小鼠心肌中，含量上升，含量下降，表明为直接靶目标，而为间接靶目标，通过影响这些心肌转录因子促进心脏结构的变化。在小鼠成年心肌中含量也很丰富，由第种肌球蛋白重链的内含子转录合成，由此构成一个新的单元。与关系密切，基因敲除的小鼠心肌、均无法表达，即除了诱导，还能诱导的转录。而在小鼠基因敲除后，人为制造高表达能发现其能起到代替的生理功能

19、，研究者认为，是直接下游信号传递者，能够诱发的转录，并起到加速慢肌纤维的相关基因表达，抑制快肌纤维基因表达。以上研究总体认为，、共同调节了环境刺激下心肌细胞变化（图）。是最高的信号始发者，其含量提高能引起、表达增加，并能加速小鼠心肌肥大的发生，且的生理功能与相近，具有协助引发肥大的作用。目前，运动对有何影响还未见报道，本文首次探究不同运动对基因转录的影响。鉴于成年小鼠心肌极少，难以检测到，故选用、两个指标。研究结果显示，组、表达显著性高于组（），表明、对一次性力竭运动比较敏感，、迅速提高表达提示小鼠心肌急性运动后和能快速转录，此过程、含量迅速上升能对下游一些靶基因产生抑制，能够产生有利于肥大产生的效应；周耐力训练对、影响有不同之处，组显著性高于组（），但提高幅度不及组，表明耐力训练同样具有提高心肌的效应，虽不