细胞冻存复苏传代转染超详细版

1、.细胞培养系列方法【实验前准备】（ 1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul 枪头、 PBS溶液。（ 2）清洁超净工作台面，照紫外 30 分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶 PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏【实验用品】（ 1） 材料：培养的贴壁细胞（ 70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（ 2） 试剂：PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（ 3） 设备：培养瓶、巴氏吸管、 15ml 离心管、 1.5ml 冻存管、盛酒精的喷壶、酒精灯、水浴锅、 CO2 培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作台。试剂配

2、制：（ 1）完全培养基含90%DMEM培养液加 10%的胎牛血清加 1%的双抗。（ 2）冻存液含 80%的 DMEM培养基加 10%的胎牛血清加 10%的 DMSO，用吸管混匀，置于 4冰箱中备用。细胞的冻存(1) 依照传代的方法用 0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。(2) 收集消化细胞于离心管中， 800-1000r/min 离心 5min。(3) 弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*10 6-1*10 7 个/ml 。(4) 每个冻存管分装细胞悬液 1.5ml ，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。(5) 在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻

3、存人名等。(6) 将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4,0.5h -20 ， 1h -80 ，过夜转入液氮灌中。;.细胞的复苏（ 1） 准备水浴锅，调温度至 37。打开离心机。（ 2） 用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管 1 只，迅速将其置入 38水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。（ 3） 用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。（ 4） 将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10 倍体积的 DMEM培养基，吹打混匀。（ 5） 1000r/min 离心 5min，弃上清液。（ 6） 加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。（ 7） 按 5*105 个/ml 的细胞浓度，

4、将细胞接种在培养瓶中， 置于培养箱中培养。（ 8） 24h 后取出培养瓶，观察细胞生长状况。【注意事项】（ 1） 对数期的细胞增值能力强， 冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。（ 2） 为了保证复苏后细胞的存活率， 复苏接种时， 细胞的浓度不能太低， 最好控制在 5*10 6-1*10 7 个/ml ，这样才能保证复苏成功。（ 3） 冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。（ 4） 复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快， 否则会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的

5、时间。（ 5） 为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。【实验结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。 复苏成功的细胞 24h 左右可贴壁， 48h 后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。;.细胞的传代培养【实验用品】（ 1） 材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞（ 2） 试剂： PBS液、 DMEM 培养基（含 10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液（ 3） 设备： 25ml 培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、 C02 培养箱【实验方案】1. 贴壁细胞的传代培养（ 1） 用吸管吸出原代培养的肝细胞培养

6、瓶中培养液。（ 2） 向瓶内加入适量的 PBS液，轻轻摇动后倒掉。（ 3） 每 25ml 的培养瓶内加入 0.25%胰蛋白酶消化液 1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜， 置于 37的培养箱环境中。 轻轻摇动培养瓶，在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，迅速将消化液吸出。（ 4） 加入 PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。（ 5） 用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免

7、损伤细胞。（ 6） 将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。（ 7） 收集细胞悬液于离心管中， 1000r/min ，离心 5-8min，去除上清。（ 8） 细胞计数，按照 1*10 5-1*106 个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2. 悬浮细胞的传代（ 1） 将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。（ 2） 800-1000r/min 离心 5min，去除上清液。;.（ 3） 加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按 1:2 或 1:3 的比例分别接种于新的

8、培养瓶中。【注意事项】（ 1） 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。 当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时， 应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密， 其消化时的时间通常比成纤维细胞长。 此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。（ 2） 首次传代的细胞因需适应新的环境， 可适当增加其接种量， 以促进生存与增殖。（ 3） 在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（ 4） 传代培养的过程通常较长， 细胞被污染的可能增加， 因此，必须严格进行无菌操作。【实验结果及分析】用倒置显微镜观察可见接种 24h 后，大多数肝细胞已贴附于

9、培养瓶底部， 有少数细胞悬浮于培养基中。 48h 以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出， 这些细胞内含物少而较为透明， 胞体轮廓通常较浅。 96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清晰、可见。;.细胞转染【实验用品】细 胞、 6 孔 板 、血 清、 培养 基DMEM 、 OPTI-MEM、 GSK-3/wt 的质 粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt 的质粒、链霉素 / 青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶1. 细胞的准备实验前一天， 将细胞接种入 6孔板中，每孔中培养基的体积为 1m

10、l，细胞环境控制在 37、 5% CO2培养箱中培养 24小时。待细胞达到 90%丰度时，准备转染，在转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。2.转染 GSK-3/wt的质粒(1) 准备无血清培养基 DMEM，OPTI-MEM，转染试剂 Lipofectamine2000。(2) 转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预热的无血清培养基。(3) 根据 Lip-2000转染说明书算出所需要的 Lip-2000的体积，根据各转染质粒的浓度算出各自所需体积见表 2。表 2 所用质粒和转染试剂的量CultureSurfaceRelative SurfaceVolumeDNA(ug)Lipo

11、fectamine2000(ul)VesselAreaArea(vs.24-well)ofandAndPerPlatingDilutionDilutionVolume(ul)Well(cm2)MediumVolume(ul)6-well1052ml4.0ug in 10ul in 250ul250ul(4) 将质粒加入 OPTI-MEM，轻轻混匀。(5) 将 Lipofectamine2000加入 OPTI-MEM后轻轻混匀后，并计时孵育 5分钟。(6) 将质粒加入 Lipofectamine2000中，轻轻混匀后，计时孵育 20分钟。(7) 20分钟后缓慢将 Lipofectamine200

12、0-质粒混合物加入培养孔中。;.(8) 37、 5% CO2培养箱中培养 24-48小时。(9) 提取细胞蛋白。注意事项（ 1） 传代细胞的准备细胞在转染前 24h 传代，待细胞密度达 90%丰度时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足 12h，细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。（ 2） 用 Lipofectin 转染时，不要用聚丙烯试管， 因为 Lipofectin 中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异结合，而影响转染结果。（ 3） 在添加 DNA-脂质体混合液前， 用无血清培养液充分洗涤转染细胞很重要，因为血清会强力抑制转染； 有些胞外基质复合物， 如硫酸蛋白聚糖， 也可抑制转染。（ 4） GFP表达的影响因素主要与转染时的温度、 PH值和观察时间有关。 同一表达载体转染同一种细胞后，分别在 33和 37条件下培养，则 33条件下培养者可观察到较强的荧光，而 37条件下培养