细胞治疗实验室工艺流程2

1、细胞治疗实验室工艺流程细胞治疗实验室工艺流程按种类分为：一、试剂耗材入库记录，试剂耗材使用记录，试剂配制记录，配制的试剂使用记录。入库需要记录产品的名称、批号、有效期、数量、存放位置、入库时间。试剂耗材使用记录包括名称、批号、用途，时间。试剂配制记录包括原料的名称、批号，配制试剂的时间、有效期、批号。配制的试剂使用记录包括使用的时间、批号、用途。二、实验记录，包括采血、分血、细胞接种、补液、质检、回输。采血有 2 个信息实验室需要记录，包括浓缩白细胞体积和血浆体积。分血有需要记录使用的分离液的量和单个核细胞数量。细胞接种需要记录DC、 CIK、 CD3AK、 T、NK 等细胞接种数量、培养基体

2、积、细胞因子添加的量。补液需要记录补液的时间和体积。质检需要做细菌真菌培养、内毒素检测、革兰氏检测，记录做这些质检的时间。回输需要记录回输的细胞种类、时间、细胞体积、细胞数量。三、细胞检测记录，包括细菌真菌培养，内毒素检测，革兰氏检测，流式检测。记录内容包括样品的来源、检测时间、结果、检测人。四、清洗消毒记录。包括清洗消毒的时间、方式、消毒有效期。DC细胞2 小时后洗版第5天加成熟剂 1第6天加成熟剂 2第7天收细胞，计算细胞存活率、细胞数后冻存或回输CIK细胞第 2天加CIK 混合因子根据细胞生长情况补液回输前3天细菌真菌培养回输前12小时革兰氏染色计算细胞存活率、细胞数后给病人回输细胞培养

3、流程图采血分血细胞计数细胞接种CD3AK细胞T细胞NK 细胞其它细胞根据细胞根据细胞根据细胞生长情况生长情况生长情况补液补液补液回输前 3回输前 3回输前 3天细菌真天细菌真天细菌真菌培养菌培养菌培养回输前12回输前12回输前12小时革兰小时革兰小时革兰氏染色氏染色氏染色计算细胞计算细胞计算细胞存活率、细存活率、细存活率、细胞数后给胞数后给胞数后给病人回输病人回输病人回输NO：_自体细胞制剂制备记录患者基本情况采血日期：姓名年 龄性别科室病案号主管医生床号传染病临床诊断病理切片细胞制备标准操作记录分血数量单位日期操作人复核人备注自体血浆体积ml白细胞体积mlFicol 体积ml批号：PBMC

4、总量9× 10DC细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、 PBMC 用量8× 102、铺瓶（板）瓶（板）3、加 DC 培养液体积ml4、 DC诱导因子（ 100X）ml批号：5、第五天加 DC成熟剂 1（ 100X）ml批号：6、 第六天补加 DC成熟剂 2（ 100X）ml批号：7、第七（八）天收集 DC7× 10CIK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、添加 IFN-rIU2、 PBMC 用量8× 103、接种体积ml4、添加 CIK 混合因子（ 100X）ml批号：第 1 次第 2 次第 3 次ml5、补液第 4 次第 5 次第 6 次CD3

5、AK 细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、添加 CD3AK 混合因子批号：（ 100X）ml2、 PBMC 用量8× 103、接种体积ml第 1 次第 2 次4、补液第 3 次ml第 4 次第 5 次T细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、 PBMC 用量9× 102、接种体积ml3 、添加T混合因子批号：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、补液第 3 次ml第 4 次第 5 次NK 细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、 PBMC 用量8× 102、接种体积ml3、添加 NK 细胞混合因子批号：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、补液第 3

6、次ml第 4 次第 5 次细胞冻存及复苏标准操作记录细胞冻存标准操作记录日期细胞细胞冻存数量冻存液存放复核人备注编号数量（支）编号操作人类型位置细胞复苏标准操作记录日期细胞细胞复苏数量复苏存放复核人备注编号数量（支）用途操作人类型位置自体细胞制剂回输记录姓名年龄性别科室病案号床号次数日期细胞类型批号体积（ ml）回输方式运送人接收人复核人123456789101112131415161718自体细胞制剂检控记录次数细胞外观细菌真菌革兰氏染色细菌内毒素最终检定结果存活率数量操作人复核人培养回输细胞批均匀悬浊液，无第一次回输前 3每次回输当天每次回输当天需经检定合格后存活率号异物天方可回输 85%

7、1是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格2是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格3是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格4是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格5是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格6是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格7是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格8是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格9是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格10是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格11是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格12是 否阳性阴性阳性阴性阳性 阴性合格不合格13是 否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格CIK 细胞培养标准操

8、作流程一、溶液的配置1、 热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入40 分钟，取出用2500 转离心 10 分钟，取出上清备用。2、 IFN-r 母液（ 1000X）：用无血清培养基配成100 万 IU/ml 。3、 CIK混合因子 (100X)：冰箱 4 度保存。56 摄氏度水浴锅内热灭活4、CIK完全培养基：无血清培养基加1%-2%热灭活自体血浆。二、CIK细胞制备：1、 血细胞单采机采集病人浓缩白细胞和血浆（80-100ml）。2、 准备 2 支 50ml 离心管，每管加入淋巴细胞分离液20ml。3、 将浓缩白细胞从血袋中取出， 直接等量加到上述2 支 50ml 离心管淋

9、巴细胞分离液上面， 2000转离心 25 分钟，升降速调到最低值。4、 取出上层的血浆收集到一支50ml 离心管中，余下的部分除红细胞外全部收集到2 支 50ml 离心管中，加生理盐水到50ml，1500 转离心 10 分钟，去除上清，合并2 支管内的细胞到一支50ml 离心管中，加 50ml 生理盐水，取 20ul 样品用于计数， 1200 转离心 7 分钟，去除上清。5、 所有的血浆留出 12 支 5ml 用于回输，其余全部56 摄氏度灭活 40 分钟，灭活完成后2500 转离心 10 分钟，收集上清备用。6、 将细胞用 CIK完全培养基配成1X106/ml ，加入 IFN-r 母液至 1

10、000IU/ml ，接种 1 个细胞培养袋，袋内加 200ml CIK完全培养基。7、 24 小时后，按 1:100 加入 CIK混合因子。8、 第 5 天，按 4 倍稀释添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培养基。9、 第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀释添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培养基。同时取样做细菌真菌培养。10、以后每隔一天按2 倍稀释补一次液，第一次回输前1 天取样送检做革兰氏染色检查。11、等拿到细菌真菌培养结果后， 检查所有结果是否为阴性。 CIK培养到第 10 天 -15 天内回输。12、回输时收集细胞于离心管内，1200 转离心 7 分

11、钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心 2 次， 1200 转离心 7 分钟。13、将收集到的细胞加入到150ml 注射用生理盐水中，加入5ml 自体血浆， 2 万 IU IL-2，留1ml 细胞悬液到 1.5ml 离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。14、 将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。DC 细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56 摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用。2、DC基础培

12、养基：用无血清培养基+2%热灭活自体血浆。3、DC诱导剂 (100X）：冰箱 4 度保存。4、DC培养基： DC基础培养基加入DC 诱导剂4、DC成熟剂 1(100X）：冰箱 4 度保存。5、DC成熟剂 2（100X）：冰箱 4 度保存。二、DC细胞制备：6养箱。2、 2 小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞（体积比其它细胞稍大），每孔加入 3ml DC 培养基。3、 第 5 天，按每孔 30ul 加入 DC成熟剂 1，取样做细菌、真菌培养。4、 收集细胞前 12 小时每孔加入 30ul DC成熟剂 2，同时取样送检做革兰氏染色检查。5、 DC培养到第 7-8 天，收集细胞，用

13、生理盐水洗3 次，分成 4 份，其中一份用于当天回输，其余冻存在 -80 度冰箱中。6、 将生理盐水清洗过的DC 细胞加入到 150ml 注射用生理盐水中，加入5ml 自体血浆，留1ml细胞悬液到 1.5ml 离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。7、 将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。CD3AK细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56 摄氏度水浴锅内热灭活 40 分钟，取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用。2、CD3AK混

14、合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、CD3AK完全培养基：无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆 + CD3AK混合因子。二、CD3AK细胞制备：1X106/ml ，接种培养瓶或培养袋培养。1、PBMC用 CD3AK完全培养基配成2、第 5 天，按 4 倍稀释添加 CD3AK完全培养基。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀释添加 CD3AK完全培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按 2 倍稀释补一次液，第一次回输前 1 天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。CD3AK培养到第 10 天 -15 天内回输。6、回输时收集细胞于离

15、心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心 2 次， 1200 转离心 7 分钟。7、将收集到的细胞加入到 150ml 注射用生理盐水中，加入5ml 自体血浆， 2 万 IU IL-2，留1ml 细胞悬液到 1.5ml 离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。 T 细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56 摄氏度水浴锅内热灭活 40 分钟，取出用 2500 转离心 10

16、分钟，取出上清备用。2、 T 混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培养基：无血清培养基 1%-2%热灭活自体血浆。二、 T 细胞制备：1、将 PBMC用完全培养基配成 2X106/ml ，加入混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，按 2倍稀释添加含 400IU/ml IL-2 的完全培养基。3、第8天到第 9天，按 2 倍稀释添加含 400IU/ml IL-2 的完全培养基。 同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按 2 倍稀释补一次液，第一次回输前 1 天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。T 培养到第 10 天 -15 天

17、内回输。6、回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2 次， 1200 转离心 7 分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml 注射用生理盐水中，加入 5ml 自体血浆，留 1ml 细胞悬液到 1.5ml离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。NK 细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56 摄氏度水浴锅内热灭活40 分钟，取出用 2500 转离心 10

18、分钟，取出上清备用。2、NK 细胞混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培养基： SCGM无血清培养基 +1%-2%热灭活自体血浆。二、 NK 细胞制备：1、将 PBMC用完全培养基配成 1X106/ml ，加入 NK 细胞混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第 5 天，添加 2 倍量完全培养基，加入 500IU/ml IL-2。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀释添加含 500IU/ml IL-2 的完全培养基。 同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按 2 倍稀释补一次液，第一次回输前 1 天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴

19、性。NK 培养到第 10 天-15 天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2 次， 1200 转离心 7 分钟。7、将收集到的细胞加入到 150ml 注射用生理盐水中，加入 5ml 自体血浆，留 1ml 细胞悬液到 1.5ml离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。细胞冻存和复苏标准操作流程一、溶液的配置1、程序降温盒的准备：按程序降温盒上的标示量加入250ml 异丙醇作为冷冻液，室温放置。2

20、、冻存液的配置：热灭活自体血浆加入 10% DMSO。9、细胞冻存1、将要冻存的细胞离心 1200rpm，7min ，去除旧的培养液。62、 轻轻混匀细胞沉淀，加入适量配制好的冻存培养液，DC 细胞调整细胞密度为5× 10/ml778，每管冻存 1-2ml。2× 10/ml ，每管冻存 0.5ml；PBMC调整细胞密度为 1× 10/ml2× 10/ml3、将细胞分装入冻存管中，在冻存管上标明细胞的名称，病人名称，病人编号，冻存时间。4、将冻存管放入室温状态的程序降温盒，直接置入-80冰箱。5、程序降温盒内的异丙醇需要定期添加，防止蒸发造成冷冻液不足。1

21、0、细胞复苏1、在离心管内先准备好冻存液体积 10 倍以上的清洗液 （DC用生理盐水、 PBMC用培养基）。2、水浴锅内水温达到 37 度。3、将冻存管放入水浴锅内，不停晃动，直到全部融化为止，一般要求在1 分钟内融化完毕。4、将细胞尽快转移到清洗液中， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，得到复苏后的细胞。其中专业理论知识内容包括：保安理论知识、消防业务知识、职业道德、法律常识、保安礼仪、救护知识。作技能训练内容包括：岗位操作指引、勤务技能、消防技能、军事技能。二培训的及要求培训目的安全生产目标责任书为了进一步落实安全生产责任制，做到“责、权、利”相结合，根据我公司2015 年度安全生产目标的内容，现与财务部 签订如下安全生产目标：一、目标值：1 、全年人身死亡事故为零，重伤事故为零，轻伤人数为零。2 、现