怎样提取脐血单核细胞地

1、实用标准文案怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）分离脐血单个核细胞。我们现在总结出最好的方法是按以下步骤1) 先用生理盐水配3% 的明胶，高压后用之前再溶化， 至 37 度左右，与脐血等量混合， 约 30 分钟，取上清液2)2000rpm离心，浓宿细胞3) 用 10ml离心管，加入4ml左右的Ficoll分离液后，加浓缩细胞液，2000rpm离心， 4) 取中间的白膜层， 即为单个核细胞此法是经过我室多种方法的比较后得出的。不会丢失单个核细胞。 3% 明胶和 HES 的作用应该是一样的，均可加速红细胞沉淀。明胶的作用就是沉淀大量的红细胞. 平均约 50ML 的脐血最

2、终可以得到单个核细胞2X10E8个细胞这个数量级我想不管做什么实验都足够了.丢失的细胞约1X10E6, 几乎不会损失. 随脐血应用范围的逐渐扩大,脐血库的建立事在必行。减小脐血体积最简单的方法是在冻存前去除红细胞。研究发现 ,明胶沉降法的造血祖细胞回收率较高,同时可去除超过95 %的红细胞。 Pick 等 8 Pick M, Nagler A , Grisaru D , et al . Expansion of megakaryocyteprogenitorsfrom humanumbilicalcordbloodusinga newtwo2stepseparationprocedureJ .

3、 Br J Haematol ,1998 ,103 (3) :639 - 650. 设计了一种新的两步法。第一步,用明胶去除大部分红细胞, 第二步 ,用 Ficoll去除残余的红细胞和中性粒细胞。结果发现 ,与单用明胶相比 ,采用明胶 +Ficoll 法在几乎完全去除红细胞的同时,对 CD34+ 细胞没有太大影响 ,而且巨核系祖细胞得到了富集。本实验采用这种方法效果较好第十八章血细胞分离技术 (Separation technique of the blood cell)一 ,原理在体外进行细胞免疫检测时,首先必须进行淋巴细胞的分离.分离淋巴细胞的方法很多,但不管采用哪种方法 ,均要求分离的淋

4、巴细胞纯度高 ,产量多 ,而且不丧失活性,同时也要求分离技术简单,操作方便 . 外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一,两类细胞的大小和密度不同,其沉降速度也就不同 .红细胞的自然沉降率较快,加入高分子量的聚合物,如明胶 ,右旋糖酐等还可以加速其凝聚.利用自然沉降法 ,密度梯度离心法或二者结合,可以将淋巴细胞从血液中分离出来.这种分离精彩文档实用标准文案出的淋巴细胞一般包括单核细胞.除去单核细胞 ,可以利用单核细胞的吸附功能,如铁颗粒 ,玻璃面或尼龙网等 ,除去 (或分离 )单核细胞 ,从而提纯淋巴细胞. 二 ,采血 (一 )材料与试剂 1.抗凝剂 (1) 肝素 :肝素是含硫酸基的粘

5、多糖 ,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固 .常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为 100U126U/mg.(2) 乙二胺四乙酸 (EDTA): 是一种螯合剂 .用生理盐水配制成4% 的溶液备用 . (3) 阿氏液 (Alsever 液 ),配方如下 : 枸橼酸钠 (Na3C6H5O7 ·5H2O) 0.80g枸橼酸 0.0325g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后 ,114.3 高压蒸汽灭菌10min 备用 . 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营

6、养 ,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液 . 2.针头 根据不同动物和采血部位 ,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒 . 3.采血容器 注射器或三角瓶等 . 4.采血动物 . (二 )操作方法 1.采血法 各种动物采血方法不一 .马 ,牛 ,羊等大动物一般从颈静脉采血 ,猪从颈静脉 , 前腔静脉或耳静脉采血 ,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血 ,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血. 2.抗凝 采集血液最关键的问题是抗凝 ,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定.最常用的方法如下 : (1)肝素抗凝 :采血时 ,

7、使每 ml 血液含 15U20U肝素即可 .计算采集的血液量 ,按 1000U/ml的量加入肝素 ,直接放入采血容器中 ,采血时 ,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀.对于采少量的血液或小动物采血 ,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝 . (2)EDTA抗凝:采血前 ,用灭菌生理盐水将 EDTA 配制成4% 溶液 ,然后按预采血液的量,以每 ml 血液加入1mg2mg 的 EDTA 的液体量于采血容器内.采血 ,并不断摇动采血容器,使之混匀 . (3) 玻璃珠法 :预先将适量的玻璃珠 (根据采血量多少而定 ) 清洗后 ,装入采血容器中 ,灭菌后备用 .采血过程中 ,边采边摇采血

8、瓶 ,以使小玻璃珠在血液中滚动 ,以机械地除去纤维蛋白 ,使血液不能凝固 .本法虽较麻烦 ,但对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂. (4) 阿氏液采血 :以阿氏精彩文档实用标准文案液和采血量以 11 比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀 .用阿氏液采血 ,除了抗凝外,多用于红细胞的保存.一般在4 条件下 ,阿氏液中保存的红细胞2 周其活性和特性不变 .三,红细胞的分离技术(一 )材料与试剂 1.肝素等抗凝剂2.3% 明胶液 取明胶 3g, 溶于 0.9%灭菌盐水 100ml 中 ,114.3 灭菌 10min, 冷却后4 冰箱保存 .临用时 ,37 预热 10min. 3.

9、阿氏液 ( 二 )操作方法1.采血抗凝 ,即为红细胞 .由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中 ,忽略不计 . 2. 根据红细胞的用途,可做进一步的处理.如计算红细胞,可直接稀释计数 .如需做补体结合反应 ,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆 .一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心 10min,重复 34次. 3.如需储藏备用 ,则以阿氏液做抗凝剂采血 ,混匀后置 4 冰箱保存 ,可保存 2 周 ,其活性尚可. 四 ,淋巴细胞的分离技术 (一) 材料与试剂 1.淋巴细胞分层液有两种 : (1) 聚蔗糖泛影葡胺液 :聚蔗

10、糖 (polysucrose solution),商品名 Ficoll, 分子量 400 000, 多配制成 40 ±1%(W/V)水溶液 ,也有干粉出售 .应用时 ,用蒸馏水配制9% 溶液 .泛影葡胺溶液 (Meglumini diatrizoici),商品名 Vrografin,结构式为 3,5 二乙酰氨基 2,4,6三碘苯甲酸 1 去氧甲氨基山梨醇 .含量为 60% 或 75%, 每安瓶为20ml 装 ,常用于人的脏器造影.应用时 ,取 60% 泛影葡胺原液20ml, 加双蒸馏水15.38ml, 即为 33.9%泛影葡胺 . 1.077 ±0.001聚蔗糖泛影葡胺的配

11、制 :9% 聚蔗糖液 24份 33.9% 泛影葡胺液10份混合即可 .必要时 ,可测比重 .需要备用 ,可用 G5漏斗过滤除菌或 114.3 高压灭菌 15min,4保存 .一般可保存 3个月 . 如要配制不同比例的分层液 ,可按下列公式计算 : 式中 dm 为分层液的比重 ,d1 和 d2分别为 9% 聚蔗糖和 33.9%泛影葡胺的比重 ,V1 和 V2 分别为它们的体积.如需配制 1.077比重的聚蔗糖泛影葡胺的分层液 ,则 9% 的聚蔗糖和 33.9%的泛影葡胺的比例应为100 46.3. (2) 泛影葡胺右旋糖酐(dextran) 液 34% 泛影葡胺液10 份 60%右旋糖酐液12.

12、5份混合 ,即为比重 1.07 1.09 的分层液 .分装于棕色瓶中 ,4冰箱保存备用. 2. 3% 的明胶液称取明胶 3g, 溶于 0.9% 的灭菌精彩文档实用标准文案生理盐水 ,终体积 100ml,114.3高压灭菌 10min, 冷却后4 冰箱保存 ,临用时 37 预热10min. 3.Hank's 液 . (二 )操作方法 1.取抗凝血 ,自然沉降 ,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上 ,让其自然沉降 1h, 取上层血浆 .如是牛 ,羊血液 ,由于其血沉速度非常慢,可加等量 3%明胶液 ,混匀后让其自然沉降 ,1h 后取上层血浆 . 2.2 000r/min离心 10min

13、, 弃上清 . 3.沉淀用Hank's 液混悬后 ,再 2 000r/min离心 10min. 4. 重复步骤3 一次 ,再用细胞营养液将白细胞制成悬液 .此液含有整个白细胞群,包括粒细胞 ,淋巴细胞 ,单核细胞和部分红细胞.可供白细胞计数用 . 5.取 2ml 细胞分层液于离心管内 ,同时用毛细吸管吸取约 2ml的血浆 (自然沉降 1h的上层血浆 )轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可 . 6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min. 离心后 ,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆 .在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层. 7.

14、用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层 ,放入另一试管中. 8.以 Hank's液洗涤 ,离心 ,最后配制成适当的白细胞浓度.必要时可计数 . (三 )注意事项1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层,不要摇动 .也可以将分层液加入到血浆的上层. 2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血 ,马上进行分离 . 3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层 ,包括单核细胞 ,不包括粒细胞 .欲分离出纯的淋巴细胞 ,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞 . 五 ,单核细胞分离技术(一)铁粉吸附法 1.材料及试剂(1) 铁 粉 或 羰 基 铁 粉 (At

15、omergicchemetals)99% 的纯度 ,颗粒小于 60 m(Goodfellow Metals). (2)强磁铁 (马蹄形 ). (3) 一块小棒状磁铁 (约 1cm长 ). (4) 毛细吸管等 . 2.操作方法(1) 称取一定量的铁粉 ,一般为 10g, 用100ml 生理盐水洗涤4 次 ,去除任何可溶性有毒物质.在倒去盐水时 ,用强磁铁吸住铁粉 . (2)用 50ml 生理盐水混悬铁粉 .摇匀后 ,分装于 10 个瓶中 ,包扎瓶口 ,121 灭菌 20min, 拿出后立即轻轻摇匀 ,防止铁粉结块 ,储藏备用 . (3) 临用前 ,倒去瓶中的生理盐水 ,加入适量的单个核细胞悬液

16、(3ml 5ml, 细胞总数为 8 ×107 个 / 瓶 ).37 温育 45min, 中间不时晃动 ,使铁粉悬浮起精彩文档实用标准文案来. (4) 加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞. (5) 倒出悬液 ,此悬液主要是淋巴细胞,离心 ,收集 . 在铁粉瓶内倒入一定量的Hank's液 ,用力振摇后 ,以强磁铁吸附,几分钟后 ,倒出液体 . (7)2 000r/min离心液体 ,管底即为单核细胞 . ( 二 )玻璃板吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内 ,置 37 30 min 40min, 用毛细吸管轻轻吸取悬液 ,即为淋巴细胞 .用适量的

17、 Hank's 液冲洗平皿 ,收获即为单核细胞悬液 . 六 ,T 淋巴细胞的分离技术 (一 )原理 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B 细胞 ,浆细胞 ,单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数 T 细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T 细胞群的有效方法 . (二 ) 材料及试剂1. 尼龙毛 (FemwallLaboratories,LP-1LeukoqakleukocyteFilters). 2. 烧杯 ,铝箔 ,漏斗 ,一次性手套等 . 3.装填尼龙毛柱 ,一次性注射器 . 4. 取自然沉降的上层血浆 ,过聚蔗糖泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层.

18、 (三)操作方法1.尼龙毛的清洗与干燥(1) 戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛 (1包或2 包 ,每包35g) 放入烧杯中 ,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min.(2) 冷却至常温 ,倒入漏斗内 ,使水滴干 . (3) 重复 (1),(2)步骤6 次 . (4) 将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37 温箱干燥 2 3 天后 ,贮藏在带盖的方盘内. 2.装尼龙毛柱(1) 取 50ml 玻璃注射器 ,拔去注射芯 ,在注射器头上套一段带夹子的胶管. (2) 将尼龙毛梳理 ,并适当折叠 ,以适应注射器的直径 ,填入注射器内 ,约 20ml的体积 . (3) 将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌 . 3.细胞分离 (1) 将注射器固定在支架上,倒入 37 的细胞培养液 ,关闭阀门一定时间 ,然后打开阀门 ,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门 . (2) 将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约 5.00 ×107 个细胞 /ml. (3) 将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱 .盖上注射器 ,37温育 45min 至 1h. (4) 打开下口 ,缓慢放流 (1