实验性癫痫与γ-氨基丁酸和谷氨酸脱羧酶的关系.

1、实验性癫痫与丫 -氨基丁酸和谷氨酸脱羧酶的关系niH!i!【摘要】目的 探索癫痫发生与丫 -氨基丁酸(GABA浓度、谷氨酸脱羧酶(GAD活性的关系。方法 采用印防己毒(PTX)腹腔注射制做SD鼠慢 性点燃模型，并将其分为对照组、癫痫发作组、发作间期组和苯巴比妥钠干预 组。用高效液相色谱仪(HPLC)测定颞区脑组织GABA浓度和GAD舌性。结果 注药第20 d , 71%的鼠达到完全点燃状态；癫痫发作组鼠颞区脑组织GABA浓度为(3.82 ± 0.81)卩 mol/g , GAD舌性为(11. 85± 2.56)卩 mol/g，较对照组(2.15 ± 0.37)卩m

2、ol/g,(7.69 ± 2.12)卩mol/g明显增高；癫痫发作间期组 鼠颞区脑组织 GABA浓度为(3.27 ± 1.42)卩mol/g , GAD舌性为(8.91 ± 2.44) 卩 mol/g，较发作期(3.82 ± 0.81 )卩 mol/g , (11.85 ± 2.56)卩 mol/g有所 下降，但高于对照组。苯巴比妥钠干预组鼠颞区脑组织GABA浓度(2.36 ± 0.61)卩 mol/g、GAD舌性(6.96 ± 2.58)卩 mol/g无明显变 化。结论在该模型中，GABAS度、GAD舌性与癫痫发作密切相关

3、，提示 GABA 能神经元的抑制功能增强是机体重要的内源性抗癫痫机制。用苯巴比妥钠和 PTX同时腹腔注射，可以预防癫痫的发生。【关键词】 癫痫；GABA 色谱法，高压液相；谷氨酸脱羧酶Relationshi p between the ep ile ptic seizure and both the GABAconcentration, and GAD activity in tem poral tissueTIAN Fafa, XIE Gua ngjie, YANG Qid ong, et al.Dep artme nt of Neurology,Xia ngya Hosp ital, Hu

4、nan Medical Uni versity, Chan gsha410008, Chi na【AbstractObjective To study the relationship between epileptic seizureand the concentration ofy -aminobytyric acid (GABA), and the activity of glutamate decarboxylase (GAD). Methods High-p erforma nee liquid chromatogra phy (HP LC) was used to determ i

5、ne the GABA content and the activity of GAD in the temp oral tissue of Sp rague-Dawley(SD) rats; SD rats were devided ran domly into four groups: con trol group (Gro up A), ep ile psy group in ictal p eriod (Gro up B), ep ile psy group in in terictal p eriod (Gro up C) and the phen obarbital group (

6、Gro up D). The kin dli ng model of rats was in duced by daily injectio n of p icrotox in (PTX) intrap erit on eally. Results The average value of temporal GABA content (3.820.81 卩 mc±mg) and GAD activity (11.85 2.5± 卩 mol/mg) in Group B was much higher than that in Group A (P <0.05). In

7、 comp arison with Group B, the temporal GABA content (3.27 ±42 卩 mol/mg) and GAD activity (8.91 2.44 ±mol/mg) in Group C were decreased, but higher tha n that in Group A. The results of GABA content and GADactivity betwee n Group A and Group D revealed no sig nifica nt differe nee. Conclus

8、iorsThe cha nges of GABA and GAD were closely related to the ep ile pticseizure. The results suggest that the augme nted GABAergic n eurotra nsmissi on is the self protective and an tic onv ulsive mecha nism in this model. Pheno barbital sodium can protect it from seizure pro vided that the SD rats

9、were give n daily injectio n of PTX intrap erito neally.【Key wordsEpilepsy;GABA ； Chromatography, high pressure liquid;Glutamate decarboxylase癫痫是神经内科的常见病，严重影响患者的工作能力和生活质量。癫痫发 作是由于大脑神经元异常放电所致，其发生机制仍不十分清楚。有关丫-氨基丁酸（GABA浓度和谷氨酸脱羧酶（GAD活性在癫痫中变化的报道存在矛盾， 这些变化是癫痫发生的原因或结果不能肯定。我们采用印防己毒（PTX）腹腔注射，制做SD鼠癫痫点燃模型，通过检测

10、癫痫发作期和间歇期脑组织GABA浓度和GAD舌性来探讨其与癫痫发生的关系，并用药物干预癫痫的发作来探讨药物 对上述指标的影响。材料与方法1. 实验动物： 健康SD鼠（由湖南医科大学实验动物中心提供）28只，68周龄，体重140180 g，雌雄各半，随机分为：（1）对照组（A组,8只）： 腹腔注射生理盐水；（2）癫痫发作组（B组,8只）:腹腔注射PTX 1.5 mg*kg-1*d- 二连续用2028 d ; （3）癫痫发作间期组（C组,6只）：模型制做成功后，停用 PTX 1周后采取标本；（4）:药物干预组（D组，6只）:每次在腹腔注射PTX 前，腹腔注射苯巴比妥钠50 mg*kg-1*d-1，

11、连续用2028 d。2. SD鼠癫痫模型的建立：按Shandra等”方法进行，每天上午8： 30 10： 00腹腔注射PTX 连续2028 d。癫痫发作的分级标准参照 Racine '2的 方法。3. 脑组织标本采集：用2%戊巴比妥腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，按住动物于器械盘中，剪开头皮及颅骨，剥去头顶骨，用高温消毒的剪刀将整个脑组 织拿出，用滤纸吸去血液，在干净的器皿中快速剪下颞区脑组织，放入冻存管，立即将冻存管置液氮中，放在-70C冰箱内保存备用。4. 脑组织匀浆制备：取脑组织在电子天平上称重，按1 ： 10（W： V）加入预冷的脑组织匀浆液，在超声匀浆器中破碎（15 s

12、X 3），在4C低温离心机中15 000Xg离心20 min，取上清液，置-20C冰箱保存，3 d内进行GABAS度和 GAD舌性检测。5. 脑组织GABAS度测定：按Chen等'可建立的高效液相色谱法进行检 测。计算方法：外标法以峰面积定量。公式如下：GABAS度=（A样/A标）X标准品浓度X标准品取样量X样品总体积 /样品取样 量X样品重量，单位：卩mol/g6. GAD活性测定：酶反应条件按 Wolf等建立的方法进行。计算方法： 将同一样品GAD反应后的GABA浓度减去反应前GABAS度，就是每克脑组织所 含GAD的活性，即每克脑组织在20 min内反应所生成的GABA勺量（卩m

13、ol/g）。7.统计学处理：测定数值用平均值±标准差（旦± s）表示。多组样本均数间比较先用方差分析，再用q检验。如果方差不齐，先进行变量转换使方差 变齐，再进行上述分析。所有数据运用 SPSS统计软件包在计算机上进行分析。结果一、癫痫模型的观察1. 发作情况：A组无癫痫发作；B组2只为m级发作，5只为W级发作，1 只为V级发作；C组均达到完全点燃后（2只m级发作，4只W级发作），停止注 射PTX 1周；D组1只为n级发作，其余无癫痫发作。2. 脑电记录：在鼠完全点燃后进行脑电记录。用橡皮套套住鼠的4只脚，固定在木板上，再用细麻绳套住鼠牙以固定头部。用2根电极，1根插入顶部

14、头皮下，1根插入同侧耳后皮下，在日本光电 5210型10导脑电机上描记脑电 活动。可见点燃鼠脑电上出现典型尖波和棘波发放。用同样方法记录正常对照组，未见癫痫样放电波。二、脑组织GABA浓度和GAD舌性的变化颞区脑组织匀浆经预处理后，用高效液相色谱 OPA柱前衍生法测定脑组织 GABAS度和GAD舌性，计算结果见表1。表1各组颞区脑组织GABA浓度和组别丫-氨基丁酸谷氨酸脱羧酶对照组2.15 ± 0.377.69 ± 2.12癫痫发作组3.82 ± 0.81 *11.85 ± 2.56*癫痫发作间期组3.27 ± 1.428.91 ±

15、2.44药物干预组2.36 ± 0.616.96 ± 2.58GAD舌性（土 s,卩 mol/g)*癫痫发作组与对照组和药物干预组比较，PV0.05癫痫发作组鼠颞区脑组织GABA浓度和GAD舌性较对照组增高，差异有显著 意义（P<0.05）;癫痫发作间期组鼠颞区脑组织 GABA浓度和GAD舌性较发作期有 所下降，仍高于对照组，与对照组、癫痫发作组比较无显著差异。苯巴比妥钠 干预组鼠颞区脑组织GABA浓度、GAD舌性与对照组比较无显著差异。讨论一、PTX点燃癫痫模型我们采用PTX腹腔注射1.5 mg*kg-1*d-1，每天上午进行。第8次注药后开 始出现惊厥发作，而Sh

16、andra等在第35次注药后大鼠开始惊厥发作，这可能 与鼠种、体重和个体差异等有关。当注射 20 d时，有71%勺鼠达到完全点燃状 态，与文献报道相似。没有完全点燃的鼠，适当增加注射次数，至完全点燃为 止，以便进一步研究。PTX复腔注射点燃癫痫动物模型属慢性继发性全身发作性癫痫模型，本模型具有以下特点：（ 1）制作方便，成功率高；（ 2）不受麻醉剂和手术过程的 影响，便于全面观察动物惊厥发作；（ 3）所需仪器设备简单，容易推广； （4）不破坏局部脑组织的结构，有利于进一步开展脑组织各项指标的检测。该 模型的主要缺点：（1）诱导过程较长，一般需要23周；（2）缺乏明确的病 灶，与人类继发性全身发

17、作性癫痫有一定的差别。在每次腹腔注射PTX之前，注射苯巴比妥钠（50 mg/kg），可以阻止癫痫的 发生。本研究中6只鼠中只有1只出现n级发作。可见，苯巴比妥钠可以有效 地预防PTX致慢性点燃癫痫模型的形成。二、颞区脑组织GABA浓度、GAD舌性与癫痫发生的关系我们发现，PTX腹腔注射致鼠点燃模型中，在癫痫发作期颞区脑组织GABA浓度明显增高，发作间期有所下降，但仍高于对照组。脑组织GABA浓度增高，其作用于突触后膜GABA受体，使抑制性突触后电位增强，起到抑制神经元异 常放电的作用。这种改变可能是脑组织对神经元异常放电的反应，随着神经元 兴奋性的变化而不同。颞区海马是边缘系统的一个重要组成部

18、分，具有广泛的 纤维联系。Liebowitz等在电剌激所致的SD鼠点燃模型中发现，海马神经 元释放GABA明显增高。Ding等在海人酸诱导的模型中发现，海马 CA、CA 区细胞外液中GABA水平增加，同时CA区苔状纤维GABA免疫活性增强。Ribak 等发现，遗传性癫痫大鼠颞叶皮质中 GABAS度明显增高。Peterson等'8'发 现，癫痫敏感性沙土鼠海马 GABA能神经元和末梢的数量增加。这些结果表明， 癫痫发作过程中GABA能神经元功能增强，与本实验结果相符合。GAD是 GABA合成的限速酶，直接影响脑组织中 GABA勺浓度。另一方面， GAD在脑组织中的分布与GABA能

19、神经元基本一致，被视为GABA能神经元的直 接标志物，而且在脑组织标本中比 GABA更稳定。因此，常通过测定脑组织 GAD 活性或GAD阳性神经元的数量、形态来反映中枢神经系统GABA能神经元的功能状态 9。我们通过HPLC测定PTX腹腔注射致点燃癫痫模型中颞区脑组织 GAD舌性发 现，癫痫发作期GAD舌性明显增高，发作间期有所下降，但仍高于对照组。结 合脑组织GABAS度的变化，我们认为，上述改变是癫痫过程中兴奋性增强，弓I 起GABA能神经元抑制功能代偿性增加的结果。本研究结果显示，GABA改变和GAD舌性变化一致，颞区脑组织 GABAS度 升高是由于GAD舌性增强所致，可能是癫痫发作后

20、GABA能神经元介入的抑制功 能代偿性增加的结果，为机体内源性抗癫痫机制增强的一种反应。 Marksteiner 等'10'在海人酸和戊四氮诱导的SD鼠癫痫模型中，用荧光检测方法发现，前脑 皮层GAD舌性明显增高，且持时间较长（1个月）；在临床检测方面，侯国庆等 11收集未进行抗癫痫药物治疗的、24 h 内未发作的癫痫患者的脑脊液，采用酶化学反应结合荧光薄层扫描方法，发现癫痫患者脑脊液中GAD舌性明显增强，病程长于 3 年的患者尤为显著。这些结果和本实验结果一致，亦认为 GAD 舌性增加是机体的一种代偿性反应。而在苯巴比妥钠干预组，颞区脑组织 GABA 浓度和GAD舌性无明显改

21、变，说明用药物预防 SD鼠癫痫发作时，没有出现这种 代偿性反应湖南医科大学附属湘雅医院神经内科） 湖南医科大学附属湘雅医院神经内科） 湖南医科大学附属湘雅医院神经内科）谢光洁 杨期东 吕冰清 陈主初作者单位：田发发（ 410008 长沙，湖南医科大学附属湘雅医院神经内科） 410008 长沙， 410008 长沙， 410008 长沙， 肿瘤研究所）参考文献1， Shandra AA, Mazarati AM, Godlevsky LS, et al. Chemical kindling: implications for antiepileptic drugs-sensitive and r

22、esistant epilepsy models. Epilepsia, 1996, 37:269-274.2， Racine RJ. Modification of seizure activity by electricalstimulation.n . Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972, 32:281-294.3，Chen BM, Xia LW, Zhao RQ. Determination of NG, N G-dimethylarginine in human plasma by high-perform

23、ance liquid chromatogphy. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1997, 692:467-471.4，Wolf R, Klemisch H. Adaptation of an enzymatic fluorescence assay for L-glutamic acid decarboxylase. Anal Biochem, 1991, 192:7881.5, Liebowitz NR, Pedley TA, Cutler RWP. Release of丫 -aminobutyricacid from hippocampal slice

24、s of the rat following generalized seizures induced by daily electrical stimulation of entorhinal cortex.Brain Res, 1978, 138:369-373.6， Ding R, Asada H, Obata K. Changes in extracellular glutamate and GABA levels in the hippocampal CA3 and CA1 areas and the induction of glutamic acid decarboxylase-67 in dentate granule cells of rats treated with kainic acid.