中检院送检细胞制剂检定项目SOP

1、1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.中检院送检细胞制剂检定项目 SOP人脐带间充质干细胞 P4 代成品细胞质量标准细胞流式检测标准操作程序逆转录病毒 PERT 法检测标准操作程序细胞基因组 DNA 提取操作标准流程细胞基因组 RNA 提取操作标准流程病毒PCR法检测标准操作程序I病毒PCR法检测标准操作程序nhUC-MSCs 免疫学反应检测标准操作程序hUC-MSCs 成骨诱导分化标准操作程序hUC-MSCs 成脂诱导分化标准操作程序细胞计数台盼蓝染色法标准操作程序细胞周期检测标准操作程序hUC-MSCs 端粒酶检测标准操作程序hUC-MSCs 软琼脂克隆形成实验

2、标准操作程序1012141619212225262831未经允许不得复印19人脐带间充质干细胞 P4代成品细胞质量标准检测项目检测方法标准规定【生物学属性】细胞形态镜检细胞贴壁生长时，呈梭形， 应为成纤维样细胞细胞计数细胞计数仪检测标示量的90%120%STR图谱多重PCR复合扩增系统检测无交叉污染细胞活率细胞计数仪检测不低于85%细胞 表面 抗原 分析CD 90流式细胞术（FCM）不低于95%CD 73不低于95%CD 105不低于95%CD44不低于95%CD166不低于95%CD 45不得过2%CD 34不得过2%CD19不得过2%CD 14不得过2%HLA-DR不得过2%【微生物学安全

3、性检查】尢菌需氧菌及真菌全自动血培养仪监测 系统检测阴性厌氧菌及真菌阴性内毒素凝胶法阴性支原体培养法阴性逆转录病毒P ERT法检测逆转录酶活性阴性HIV-1荧光PCR核酸检测阴性HBV荧光PCR核酸检测阴性HCV荧光PCR核酸检测阴性HCMV荧光PCR核酸检测阴性EBV荧光PCR核酸检测阴性HPV荧光PCR核酸检测阴性人细小B19病毒荧光PCR核酸检测阴性HHV6/7PCR核酸检测阴性HTLVPCR核酸检测阴性猪细小病毒PCR核酸检测阴性猪细环病毒PCR核酸检测阴性猪圆环病毒PCR核酸检测阴性牛副流感病毒PCR核酸检测阴性牛腺病毒PCR核酸检测阴性牛细小病毒PCR核酸检测阴性牛腹泻病毒PCR核

4、酸检测阴性牛呼肠孤病毒PCR核酸检测阴性【生物学活性检查】诱导分化能力检测成骨成脂诱导分化染色法具有成骨成脂诱导分化潜成瘤性检测软琼脂克隆生长试验能克隆形成细胞流式检测标准操作程序目的： 对细胞表面抗原进行流式鉴定，保证检测的准确性。范围： 细胞流式检测的全过程责任人： 技术部内容4.1 仪器和试剂4.1.1仪器设备：流式细胞仪（FACS Calibur）、台式离心机、1000uL微量移液枪、100讥微量移液枪、10uL微量移液枪。4.1.2 试剂以及耗材：FITC单克隆抗体、APC单克隆抗体、PE单克隆抗体、PerCP单克隆抗体、相应的同型对照；1XPBS;鞘液专用流式管、枪头。4.1.3

5、样本准备4.1.3.1将样本按条码号顺序排列好，每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支，分别标记好单阳管、阴性管、同型对照管和样本检测管。4.1.3.2各取100 uL羊本加入标记好的流式管中，然后根据流式管标记的信息分别添加对应的抗体。充分混匀，置 4 C冰箱避光孵育30分钟。4.1.3.5孵育结束以后加入1ml PBS,充分混匀,1200rpm 离心 5 分钟。4.1.3.7弃上清液，加入 300卩L PBS充分混匀,随后上机检测。4.2 仪器开机程序4.2.1 依次打开稳压电源 ,主电源,流式细胞仪电源,计算机。4.2.2开启电脑，在出现的密码登录框中，输入BDIS，按Ente

6、ro4.2.3打开鞘液筒抽屉,检查鞘液筒和废液筒存液情况,鞘液筒空则需要加液,废液筒满则取出倒除,检查管路是否有气泡,否则应排除,没有问题以后,打开鞘液压力开关。4.2.4开机后，仪器预热 5min，即可开始进行实验。4.2.5实验之前,仪器清洗,专用流式管装满双蒸水,放置仪器吸液管下,设备“ run+high情况下，然后PRIME （排空气）模式运行两次。4.2.6 流式细胞仪上羊前 FAScomp 质控分析4.261标准微球的制备（标准微球“Cal BRITE beads保存4度）三色检测： 管 1：1 滴 Unlabeled+0.5ml 鞘液（或者 0.5ml 蒸馏水）管 2：1 滴 u

7、nlabeled+FITC,PE,Percp 各一滴 +1ml 鞘液四色检测： 管 1 ： 1 滴 unlabed+1 滴 APC+0.5ml 鞘液管 2：1 滴 unlabed+FITC,PE,Percp,APC 各一滴 +1ml 鞘液4.2.6.2打开FAScomp软件，在“ sigh in窗口下，输入信息，然后“ accept进入“ set up ”窗口。4.2.6.3"set窗口下，选择分选模式：“ Lyse/wash （用于溶血素洗涤样本）（通常选择该模式），“Lyse/No wash”、用于溶血处理后的免洗样），然后输入 CaliBRITEBeads ”批号批号为 6 位

8、编码，最后一位为大写字母），选择存储文件。4.2.6.4然后点击“ RUNf,进入PMT窗口，在该窗口下，用管1为样品，选择“ RUN-/high。点击“starti动调节光电倍增管的电压,屏幕出现闪烁PMTS set successfully 点 ”击 “NEXT。4.265在“COMP窗口下，用 管2”为样品,选择 “ RUN/HIGH',点击“ START,可执行自动调节荧光补偿： FL1-%FL2,FL2-%FL1和 FL3-%FL2,屏幕出现 “COMPENSATIONSET SUCCESSFULL Y” 便可点击出 “ NEXT'。4.2.6.6在“ sen窗口下，

9、依然用管 2为样,点击“ start可自动检测各参数灵敏度。4.2.6.7在“ summary report下得到所有检测的结果。4.2.6.8质控完成后，移去标准微球管并插上双蒸水流式管，在“ summary report 状态下，点击“quit键，或从“file menu中选择“quit退出程序。4.2.7打开cellquest pro软件，按” common+B组合键，连接流式细胞仪。4.2.8 从 “cytometer菜"单 中选择 “detectors （或者键盘 “common+1、）“threshold （或者“com mon+2”）“ compen sati on 或

10、者键盘 “ com mon+3'、）“ status 键'"（com mon+4"将出现各自对应的窗口，将其拖至空白处。Cytometer 视窗，观察软件与细胞仪4.2.9 确定软件与细胞仪完成连接。如果有必要，可点击是否完成连接。4.2.10完成连接后，在 Cytometer视窗下方会显示 Cytometer Connected。检视各项试剂液面是否正常。在 Cytometer 视窗右下方会显示各项试剂液面高度。视实验需要补充FACSFlow ，倒除废液。如果视窗下方显示 Cytometer Disconnected ，可尝试重新启动Cellquest p

11、ro 软件。4.2.11 接着可以开始规划实验挡、或设置仪器。4.3 上样检测4.3.1在工具板中选择点图，在文件的空白区点击，然后拖动对角线至所需大小， 出点图对话框，点击“plottype "选择“acquisition->analysis ; X, Y轴默认为FSC、SSC,然后上阴性管，调节FSC、SSC电压，再设置目标细胞群“ region,该“ region在调节荧光探测器时使用，在工具板中选择多边形“region,”在FSC/SSC散点图上，设淋巴细胞“region,”该 “Region在调节荧光探测器时使用；在工具板中选择多边形的“Region"在FS

12、C/SSC点图上，设目标细胞群 “region ”在“region外点击，将拖至空白区。然后建立FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4 点图，选择 “G1=R1 ,在工具板上选择象限标尺，三个点图上画象限，指定阴性/阳性区域，调节FL1、FL2、FL3、FL4电压，使细胞群调在各点图所在图的左下角，点击“ Acquisition control 窗 口中的 “ pause移，去阴性对照管。4.3.2依次上FITC、PE、Percp、APC单阳管，必要时,调节 FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL2-%FL3、FL3-%FL2、FL3-%FL4、FL4-%FL3 的补偿，调节完成后，

13、点击“ acquisition control窗口”中的“pause abort ”移去单阳管。4.3.3插上同型对照管，删除FL1/FL2、 FL3/FL2、FL3/FL4点图，建立FL1、FL2、FL3、FL4 直方图，点击 “ acquisition control 窗口中的 “pause abort，” 之后 Setup 之面方框去掉，然后点击Acquire,收集10000个细胞，然后同型管图型外阳性区域画直方图Marker,设定Marker左右边界，移去同型对照管。4.3.4插上样本检测管，点击“ acquisition control窗口中的 “pause abort "

14、之后Setup之面方框送掉，然后点击 Acquire,收集10000个细胞，结束以后，移去样本管，插上双蒸水管，将 仪器处于“ sta ndby状态。4.3.5分析数据，选中一个图表，点击菜单中stats,选择“ Histogram Stats出现该选中图的数据分析结果，选择Stats菜单下的“Edit Histogram Stats，岀现对话框，去掉一些不需要的参数，点击OK。4.3.6数据储存，首先在 Cytometer视图菜单下选择Instrument Setting保存数据条件，然后Files视图菜单下选择saveDocument as保存数据模板，之后可使用相关软件进行数据分析。4.

15、4仪器关机程序4.4.1换上双蒸水管。4.4.2在High+Run条件下，运行3min , 2次，然后PRIME+high进行排空气2次。4.4.3点选 File >> Quit退出软件。关闭细胞仪，关闭电脑。如有必要，请加入1/10体积漂白水，再倒掉废液，避免生物性危险。4.4.4填写运行记录。5修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期支原体培养法检测标准操作程序目的：规范培养法检测支原体的标准操作程序范围：细胞产品中支原体的检测责任人：技术部内容4.1实验试剂耗材4.1.1仪器：生物安全柜，二氧化碳培养箱，电动移液器，移液枪4.1.2耗材：EP管，200 1枪头，5ml移

16、液管，15ml离心管4.1.3试剂：支原体培养法检测试剂盒4.2实验步骤4.2.1用5ml移液管取细胞培养上清于15ml离心管中备用。4.2.2取出试剂盒的测试板准备种样本，移液枪吸取100UI培养液加入A1-空白对照孔。4.2.3将100ul细胞培养上清加到 UU-MH培养瓶中，混匀。4.2.4吸取100ul UU-MH培养瓶中的混合液体分别接种到样本检测的微孔中,所有微孔滴加1-2滴试剂盒中的矿物油。接种标本的培养基培养4.2.5将测试板加盖后置培养箱中35-37 °C培养24-48小时，观察结果: 后，澄清透明不变色为阴性，澄清透明并呈明显红色为阳性。4.2.6若偶遇培养基变浅

17、红色（即变色不明显），建议延长1224h培养报结果（可能刚感染支原 体，标本中支原体数量过少或受抗生素抑制作用而使变色不明显 5记录5.1试剂盒的支原体鉴定报告单 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期逆转录病毒PERT法检测标准操作程序目的：规范质量检验中逆转录病毒PERT法检测标准操作程序范围：细胞产品中逆转录病毒的检测责任人：技术部原理逆转录病毒是一大类含有逆转录酶的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科和泡沫病毒亚科。逆转录病毒进入宿主细胞后，以RNA为模板逆转录合成双链 DNA , DNA被整合酶整合至宿 主染色体形成前病毒，建立终生感染并可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。

18、基于这一共同特点，可MS2噬菌体RNA为模板，在合再以逆转录反应液为模板，以MS2通过检测逆转录酶活性来检测细胞样品是否被逆转录病毒污染。以 适的反应条件下，利用待检细胞的裂解液或者培养液进行逆转录, 噬菌体基因组特异性引物进行 PCR,根据PCR的结果即可判断待检样品是否受逆转录病毒污染。5内容5.1实验物品的准备5.1.1仪器：Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统5.1.2 试齐 1：MS2 噬菌体 RNA、去 RNase 水、逆转录酶、2 X EasyTaq DNA聚合酶、DNA Marker、MS2噬菌体基因组特异性引物、Ribo nuclease

19、 In hibitor、琼脂糖5.2实验步骤5.2.1样品制备收集培养的hUC-MSCs约1X106,加入100卩L PBS置于-20 C冰冻30 min ,然后室温融化，反复冻融三次以裂解细胞,10000g离心10min，取上清液备用。5.2.2对照设置 以逆转录酶为阳性对照，此时逆转录酶体积为1 yL,去RNase水的体积相应 变化，保持总反应体系为 20 uL;以去RNase水为阴性对照。5.2.3逆转录体系如下:成分体积（yL）RNase-free water112.5 mM dNT P45X RT Buffer110 mM primer0.5Ribon uclease In hibi

20、tor0.5MS2 RNA2待检样品4总体积2042C反应30 min , 85C加热5 min使拟转录酶灭活。524 PCR体系如下:成分体积（1L）2XEasyTaq DNA poly merase1010M Primer_F110M Primer_R1逆转录反应液1ddH207总体积20PCR程序如下:过程温度时间预变性95 C5 minPCR反应（35个循环）94 C30 sec59 C30 sec72 C20 sec延伸72 C1 min5.2.5凝胶电泳取5卩LPCR产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。电压为120V，时间为30 min。电泳结束,利用凝胶成像仪拍照。预期PCR产物

21、阳性对照必须有308 bp条带出现，阴性对照必须无任何扩增, 否则实验无效。6记录6.1逆转录病毒检测实验记录 7修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期细胞基因组 DNA 提取操作标准流程目的： 规范质量检验中从细胞中提取 DNA 的标准操作范围： 细胞基因组 DNA 提取责任人： 技术部内容4.1 实验物品的准备4.1.1 试剂： DNA 快速提取试剂盒、异丙醇4.1.2耗材：10 mL移液管、5 mL移液管、50 mL离心管、10卩L & 200 枪头、1.5 mL EP管4.1.3仪器：掌上离心机、混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、Nanodrop 微型分光光度计4.2

22、实验步骤4.2.1提前打开水浴锅，设置为 70 C,预热高压的去离子水（溶解 DNA用），将细胞沉淀（滴度测定实验准备的新鲜样品或-80 C冻存样品）用180L的PBS重悬。4.2.2加入20 uL蛋白酶K溶液（用之前震荡混匀离心），充分震荡混匀，瞬离，加入200讥结合液CB，立刻涡旋震荡，充分混匀，70C水浴锅内放置20 min （10 min时震荡混匀一次）。4.2.3瞬离（为避免管盖沾有液体），加入 100卩漂异丙醇，立刻涡旋震荡，充分混匀，此时可能出现絮状沉淀。4.2.4瞬离（为避免管盖沾有液体），将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）（加之前吹打

23、两下，使之混匀），加入后立即盖好盖子，防止异丙醇挥发，13000 rpm, 1 min , 20C,离心，倒掉收集管中的液体。4.2.5加入500抑制物去除液IR （用之前摇一下混匀）12000 rpm, 1 min, 20 C 离心，弃掉废液。4.2.6加入500漂洗液WB （检查已加入无水乙醇），12000 rpm, 1min , 20 C 离心，弃掉废液。4.2.7加入500卩漂洗液WB （检查已加入无水乙醇），12000rpm, 1 min, 20 C 离心，弃掉废液。4.2.8将吸附柱AC 放回收集管中, 13000 rpm, 2 min,20 C离心，尽量除去漂洗液，以免漂洗2 m

24、in，使乙醇完全挥发，如样50卩预热过的高压的去离子液中残留的乙醇抑制下游反应。4.2.9 取出吸附柱 AC ，放入一个干净的离心管中，打开盖子静置品较多，晾干 2分钟后需盖上所有管盖；在吸附膜的中间部位加水，70 eK浴锅中放置 5 min , 13000 rpm , 1 min , 20 C,离心。4210利用Nanodrop检测所提 DNA溶液浓度，要求 A260/A280在1.8-2.0之间，A260/A230大于2.0。DNA溶液储存于4 G或-20 C待用。5记录5.1内外病毒DNA因子检测记录 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期细胞基因组 RNA 提取操作标准流程目

25、的： 规范质量检验中从细胞中提取 RNA 的标准操作 范围： 细胞内 RNA 提取 责任人： 技术部 内容4.1 实验物品的准备4.1.1 试剂：Easy Pure? RNA Purification kit 、70%乙醇、3 -巯基乙醇4.1.2 耗材：10 卩 L & 200 卩 L& 1000 枪头、1.5 mL EP 管Nanodrop 微型分光光度计4.1.3 仪器：掌上离心机、混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、4.2 实验步骤4.2.1 样品处理收集细胞，离心得到的细胞沉淀，去除上清后，轻弹离心管底部，细胞细胞沉淀检散，加入相应体积的裂解液 BB4 （每1ml BB

26、4加入10ul 3 -巯基乙醇，现配现用），剧烈涡旋，直至细胞沉淀分散均匀。（注意：当细胞量1*106,BB4用量0.3ml;当细胞量1*10人65*106,BB4用量0.6ml）4.2.2 均质化处理用 RNase-free 的针管反复吹吸 5-10 次，使溶液合均匀质化，然后室温 12000g 离心 5min,吸上清于一 RNase-free的离心管中。4.2.3 RNA 提取4.2.3.1 向上清中加入 1 倍体积的 70%乙醇，涡旋彻底混匀，分散沉淀，将得到的溶液和沉淀起加入离心柱中，12000g离心30s，弃掉流出液。4.2.3.2向离心柱中加入 500ul CB4,室温12000g

27、离心30s,弃掉流出液。4.2.3.3去除基因组：向离心柱中英加入80ul的DNase I工作液，室温放置 15min,向离心柱中再次加入500ul CB4,室温12000g离心30s弃掉流出液。4.2.3.4离心柱中加入 500ul WB4,室温12000g离心30s，弃掉流出液；重复该步骤一次。4.2.3.5室温12000g离心2min,彻底去除残留的乙醇，在室温敞开静置数分钟彻底晾干离心柱。4.2.3.6 将离心柱转入一个新的 1.5ml RNase-free 的离心管中，并向离心柱中英加入 30-100ul37C预温的 RNase-free Water,室温静置1min,然后室温120

28、00g离心2min,洗脱RNA。4.2.3.7利用Nanodrop检测所提RNA溶液浓度。RNA溶液储存于-20 M -80 Q呆存待用。5记录5.1内外病毒 RNA因子检测记录 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期病毒PCR法检测标准操作程序I目的：规范质量检验中用 PCR法检测病毒核酸的标准操作程序范围：细胞产品中内外病毒 DNA的检测责任人：技术部内容4.1实验物品的准备4.1.1仪器Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统4.1.2试齐U猪源病毒PCR试剂盒、HHV6/7试剂盒、牛细小病毒/牛腺病毒PCR试剂盒、琼脂糖4.2实验步骤4.2.

29、1样品DNA的制备用自选方法提取纯化样品的DNA，并检测 DNA 浓度，要求 A260/A280在1.8-2.0之间;A260/A230 大于 2。4.2.2对照设置将试剂盒自带的阳性对照稀释1000倍，稀释后浓度为105拷贝/ uL作为阳性对照。以ddH20作为阴性对照。4.2.3 PCR 扩增PCR体系如下:成分体积（uLL2 XPCR MagicMix 3.010病毒PCR引物混合液2DNA模板1ddH207总体积20PCR程序如下:过程温度时间预变性95 C5 minPCR反应（35个循环）最后延伸95 C15 sec55 C15 sec72 C20 sec72 C10 min4.2.

30、4电泳检测取5卩L PCR产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。电压为120V，时间为30 min。电泳结束，利用凝胶成像仪拍照。预期PCR产物阳性对照有相应的条带出现，阴性对照无任何扩增条带，否则实验无效。5记录5.1内外病毒DNA因子检测记录 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期病毒PCR法检测标准操作程序H目的：规范质量检验中用 PCR法检测病毒核酸的标准操作程序范围：细胞产品中病毒 RNA的检测责任人：技术部内容4.1实验物品的准备4.1.1仪器Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统4.1.2试齐U牛病毒性腹泻病毒/牛副流感/牛呼肠弧病毒P

31、CR试剂盒、琼脂糖4.2实验步骤4.2.1样品RNA的制备用自选方法提取纯化样品的RNA，并检测RNA浓度.4.2.2 RNA质量鉴定120V，时间30min.电泳结果要求浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件条件为：电压28s和18s条带清晰，且亮度符合 2： 1.表明RNA完整。4.2.3样品检测4.2.3.1逆转录逆转录体系:试剂用量（jiL）RNase-free water6.5dNT P( 2.5 mM each)45 X RT buffer4BVDV_F/BVDV_R(10卩Ma各0.5Ribonu clease In hibitor(50U/ 卩 L)0.5RNA b3Reve

32、rse Tran scri ptase1Total20逆转录程序:温度（C）时间（min）25104230855423.2 PCR 扩增PCR体系:试剂用里（jiL2 X M ix Taq DNA聚合酶10ddH2O8正向引物BVDV_F （ 10 小0.5反向引物BVDV_R （10 小0.5逆转录反应产物1以含相应DNA片段的质粒为阳性对照，以出0为阴性对照。PCR程序:温度（C）时间（s）循环数953009530355530721072604.2.4电泳检测取5卩L PCR产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。电压为120V，时间为30 min。电泳结束，利用凝胶成像仪拍照。预期PCR产物

33、阳性对照有相应的条带出现，阴性对照无任何扩增条带，否则实验无效。5记录5.1内外病毒 RNA因子检测记录 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期未经允许不得复印仃hUC-MSCs 免疫学反应检测标准操作程序1目的：规范质量检验中检测hUC-MSCS寸T淋巴细胞增殖抑制及 Th1/Th17/Treg亚群影响的标准操2范围：hUC-MSCS寸T淋巴细胞增殖抑制及 Th1亚群影响3 责任人： 技术部4 内容4.1 实验物品的准备仪器：洁净工作台，倒置相差显微镜，细胞培养箱，酶标仪，离心机，移液枪，流式细胞仪试剂&耗材：CD3磁珠分选试剂盒， 刀豆蛋白A （ConA） , MTT检测

34、试剂盒，DMSO培养基，胰酶,PBS 台盼蓝染色液，流式抗体anti-human 丫 -IFN , anti-human CD3 anti-human CD8, anti-丫 -IFN、TNF-a ELISA 试human CD4,anti-human IL-17A,anti-human CD127,anti-human CD25剂盒， 96 孔细胞培养板4.2 实验步骤4.2.1实验共分为两批次。第一批次用于检测hUC-MSCs对异体人外周血 T淋巴细胞的抑制作用，设4组：阴性对照组（不同浓度的T淋巴细胞）；阳性对照组（ConA环同浓度的T淋巴细胞）；实验组（ConA环同浓度的T淋巴细胞与h

35、UC-MSC共孵育培养），T淋巴细胞（T）与hUC-MSCsS S）比例T:S分别为100:1、50:1、10:1、1:1 ;空白对照组（单独hUC-MSCS。接种96孔细胞培养板,体系为200卩1/孔，每组设置3个复孔，于37 C、5%a养箱培养3天。通过 MTT法检测hUC-MSCs对异体人外周血 T淋巴细胞的抑制作用。第二批次用于hUC-MSCs对异体人外周血 T淋巴细胞抑制作用后Th1淋巴细胞的流式检测，设2组：阳性对照组（Co nA环同浓度的T淋巴细胞），实验组（ConA+不同浓度的T淋巴细胞与hUC-MSCs共孵育培养，T:S比例分别为100:1、50:1、10:1、1:1 ）,培

36、养 3 天后 anti-human丫 -IFN , anti-human CD3 anti-human CD8, anti-human CD4,anti-humanIL-17A,a nti-huma nCD127,a nti-huma n CD25 与各组细胞结合，采用流式细胞术检测 Th1/Th17/Treg淋巴细胞亚群，培养液用丫 -IFN和TNF-a ELISA试剂盒测定胞包因子分泌量。每批次实验重复次。4.2.2 实验操作4.2.2.1 hUC-MSCs 铺层未经允许不得复印23细胞接种：接种 96 孔培养板，根据共培养所需接种hUC-MSCs计算孔数，每个不同的比例T：S 设置 3

37、个平行孔，共计 12 孔，接种相同量的 hUC-MSCs贴壁后S 24小时），经 60Co射线12.5Gy(1Gy/min)照射去除其增殖分化能力，去除培养液备用。4.222 人外周血CD3+T淋巴细胞的制备采集外周血10ml,分离PBMC细胞。添加CD3磁珠孵育30min，过柱分选得到 CD3+T淋巴细胞。室温1000rpm离心10分钟，洗2次。以台盼蓝染色法进行活细胞计数，细胞活性率需在99%以上。用不含血清的 hUC-MSCs专用培养基培养调节细胞浓度为1 X 106/ml，室温放置备用。4.2.2.3细胞增殖抑制检测根据T:S不同的比例，接种 200卩l备好的T淋巴细胞至hUC-MSC

38、S甫层照射后的96孔板实验组的各孔，除hUC-MSCs空白对照组外，根据实验组接种不同浓度的T细胞，对应浓度设置阴性对照组和阳性对照组，各孔添加备好的T淋巴细胞，体系定容至 200ul，然后置于37 C, 5% CO2培养箱中培养；2小时后，阳性对照组与实验组加入Co nA,终浓度为16 g/ml。培养3天后，每孔细胞加入 MTT( 5 mg/ml ) 50卩l。孵育4小时，离心弃上清，加入DMSO 10 l 振荡 10min，充分溶解后上酶标仪， A492比色测OD值。结果判断：以各浓度平均OD值计算增殖抑制率(Supp ressionRate, SR): SR= 1-(实验组OD值-空白对

39、照组 OD值-阴性对照组 OD值)/邙日性对照组 OD直-阴性对照组 ODB)X 100%以细胞增殖抑制率大于 30%且与阳性对照组比较 P<0.05为有抑制作用。4.2.2.4 流式与ELISA检测接种200卩l备好的T淋巴细胞至hUC-MSC铺层照射后的96孔板实验组的各孔，同时设置阳性对照组，各孔添加200卩l/孔备好的T细胞，置于37C, 5% CO2t养箱中培养；2小时后，各孔加入ConA,终浓度为16 1 g/ml ;培养至第3天，收集细胞分别加入流式抗体anti-human 丫 -IFN , anti-humanCD3 anti-human CD8, anti-human

40、CD4,anti-human IL-17A,anti-human CD127,anti-human CD25等；室温孵育30min, PB就涤离心，之后添加固定剂固定 15min,再次用PBS洗涤，接着添加破膜剂及流式抗体anti-human 丫 -IFN再次室温孵育20min，按照流式细胞术标准四色荧光检测法上机检测;离得到的培养上清，用 ELISA试剂盒分别测定胞外丫-IFN、TNF-a分泌的含量。5记录5.1免疫学反应检测实验记录6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期未经允许不得复印25hUC-MSCs成骨诱导分化标准操作程序目的：规范hUC-MSCs成骨诱导分化标准操作程序范

41、围：hUC-MSCs成骨诱导分化操作责任人：技术部内容4.1试剂耗材4.1.1仪器:生物安全柜，二氧化碳培养箱，离心机，细胞计数仪，倒置显微镜，冰箱，电动移液器，移液枪4.1.2耗材:EP管，1000卩、1 100卩、1 10 移液枪及枪头,15ml 1 50ml 离心管，5ml、10ml 移液未经允许不得复印29管，24孔板4.1.3试齐1:培养基，成骨分化试剂盒，茜素红S, PBS,dH204.2实验步骤4.2.1试剂耗材：实验前将培养基、诱导成骨完全培养基从4 C冰箱取出，放置室温。4.2.2 hUC-MSCs悬液计数后用培养基缓慢吹打重悬细胞，根据铺板密度35x103 个/cm2，对

42、24孔板进行铺板（板底面积2 cm2），即6 x1031 x104个/孔，培养2-4天，促进成骨分化能力，保证细胞融合度在6080%。4.2.3 48h后从培养箱中取出 24孔板，小心吸去培养基，枪头勿触板底，每孔加入1ml PBS，沿板壁缓缓打入后晃动 24孔板洗涤细胞，弃掉 PBS。4.2.4每孔加入1ml常温预热的成骨诱导分化培养基，放置37 C, 5% CO2培养箱中继续培养。每三天换液，每次加入常温成骨诱导分化培养基1ml/孔。4.2.5诱导分化条件下，细胞成骨诱导分化培养20-28天。4.2.6染色过程：小心吸去培养基，枪头勿触板底，每孔加入1ml PBS洗涤细胞，弃掉 PBS。重

43、复洗涤三次。每孔加入 0.5ml 4%多聚甲醛，固定30 min，弃掉4%多聚甲醛，PBS洗涤1-3次。然后每孔加入茜素红 S,染色完当天拍照。5记录：成骨诱导分化检测记录6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期PBS4 C冰箱取出，放置室温。4.2.2 hUC-MSCs悬液计数后用培养基缓慢吹打重悬细胞,根据铺板密度35x103 个/cm2，对 24孔板进行铺板（板底面积2 cm2），即6 x1031 x104个/孔,培养2-4天，促进成脂分化能力，保证细胞融合度在6080%。4.2.3 48h后从培养箱中取出 24孔板，小心吸去培养基，枪头勿触板底，每孔加入1ml PBS，沿板壁缓

44、缓打入后晃动 24孔板洗涤细胞，弃掉 PBS。4.2.4每孔加入1ml常温预热的成脂诱导分化培养基ADP1，放置37 C, 5% CO2培养箱中继续培养。诱导3天后换液，吸去原有培养基，每孔加入1ml常温成脂诱导分化培养基 ADP2 ; ADP2诱导一天后，吸去 ADP2培养基，更换成脂诱导分化培养基ADP1继续诱导培养；试剂盒中ADP1-ADP2交替诱导3-5次后，根据需求对细胞进行染色和后续鉴定。4.2.5 MSC分化条件下，成脂诱导为14-21 天。目的：规范hUC-MSCs成脂诱导分化标准操作程序范围：hUC-MSCs成脂诱导分化操作责任人：技术部内容4.1实验试剂耗材4.1.1仪器：

45、生物安全柜，二氧化碳培养箱，离心机，细胞计数仪，荧光倒置显微镜，组织倒置 显微镜，冰箱，电动移液器，移液枪4.1.2耗材：EP管，1000卩、1 100卩、1 10 移液枪及枪头，15ml、50ml离心管，5ml、10ml移液 管，24孔板,4.1.3试剂：培养基，成脂诱导分化试剂盒，油红O,4.2实验步骤4.2.1试剂耗材：实验前将培养基、诱导成脂完全培养基从1ml PBS洗涤细胞，弃掉 PBS。重4.2.6染色过程：小心吸去培养基，枪头勿触板底，每孔加入 复洗涤三次。每孔加入 0.5ml 4%多聚甲醛，固定30 min，弃掉4%多聚甲醛，PBS洗涤1-3次。然后 每孔加入油红0,染色完当天

46、拍照。5记录：成脂诱导分化检测记录 6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期hUC-MSCs 成软骨诱导分化标准操作程序目的： 规范 hUC-MSCs 成软骨诱导分化标准操作程序范围： hUC-MSCs 成软骨诱导分化操作责任人： 技术部内容4.1 实验试剂耗材4.1.14.1.2仪器：生物安全柜，二氧化碳培养箱，离心机，细胞计数仪，荧光倒置显微镜，组织倒置显微 镜，冰箱，电动移液器，移液枪 耗材：EP管，1000卩1& 100卩I&10 移液枪及吸头，15ml&50ml 离心管，5ml&10ml移液管,24 孔板，4.1.3试剂：培养基，成软骨诱导分化

47、试剂盒，阿利新蓝染色，4%多聚甲醛， 100% 、95% 、80% 、70% 、30%各不同浓度酒精， PBS，中性树脂。未经允许不得复印#4.2 实验步骤4.2.1试剂耗材准备及溶液配制：实验前将培养基、诱导成软骨诱导分化试剂盒和配套因子放置室温进行温度平衡，根据试剂盒使用说明书，配制预混液及诱导完全培养基。4.2.2准备所需诱导分化的 hUC-MSCs ，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬， 150g 离心 5 min ，沉淀以预混液重悬，细胞密度约1 X 106 cells/ml，再次离心，弃上清；沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为1 X 106 cells/ml。分别取50

48、0 细胞悬液接种于15ml离心管中，150g离心5min，旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37 C、5% CO2 培养箱中静置培养。4.2.3诱导培养 24 小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。4.2.4诱导 72h 后，细胞球状明显可见，此时，更换成软骨诱导完全培养基，同时小心吸取细胞球转移至 24 孔板中培养，之后每间隔 2 天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸取旧培养基，每孔加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500卩。4.2.5诱导培养 20 天，弃去培养上清， DPBS 洗细胞两次， 4%中性多聚甲醛溶液 2 ml/ 孔室温固定细胞 1 小时。4.2

49、.6弃去固定液， DPBS 洗 2 次，脱水、石蜡包埋后切片（此操作外送第三方处理）。4.2.7阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30min ，流水冲洗 5min ，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。5 记录： 成软骨诱导分化检测记录细胞计数台盼蓝染色法标准操作程序6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期未经允许不得复印35目的：规范细胞计数台盼蓝染色标准操作程序范围：各类细胞计数及活率测定责任人：技术部内容4.1试剂耗材4.1.1仪器耗材：CountSTAR计数仪、移液枪、计数板、无菌枪头、EP管等;4.1.2试剂：PBS、台盼兰染色液。4.2实验步骤4

50、.2.1供试品处理制备细胞为单细胞悬液，并且适应稀释。4.2.2染色 细胞悬液与0.4%台盼蓝染色液以9: 1混合均匀，吸取10ul混合液加入计数板槽中。4.2.3计数计时静置等待2min,通过CountSTAR计数仪读数活细胞、总细胞及活率。4.2.4统计计算总细胞量：总细胞 =活细胞*稀释倍数*体积。5记录5.1细胞计数及活率测定实验记录6修订记录序号版本号修订内容摘要修订人/修订日期细胞周期检测标准操作程序目的： 规范质量检验中细胞周期检测的标准操作范围： 细胞培养各阶段周期的检测责任人： 技术部内容4.1 实验物品的准备4.1.1试剂：胰酶、PBS、培养基、台朌兰染色液、细胞周期与细胞

51、凋亡检测试剂盒、预冷PBS 、70% 乙醇4.1.2 耗材：5 mL 移液管、15 mL 离心管、200 卩 L & 1000 枪头、1.5 mL EP 管、Countstars细胞计数板4.1.3 仪器：混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、流式细胞仪、CountSTAR 计数仪、生物安全柜、电动移液枪、手动微量移液枪4.2 实验步骤4.2.1 供试品处理4.2.1.1 新鲜培养的 hUC-MSCs 贴壁生长至第 3天对数生长期和融合达到 80%-90% ，以0.125%胰酶消化处理，收集所得细胞悬液，用 D-PBS 洗涤一遍后，在室温下以台盼兰染色法进行细胞计数并检测活率。4.2.1.2 根据计数每个样本取约 50 万左右细胞至 1.5mlEP 管中，加入约 1 毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，离心结束后小心吸除上清